초록 ▼

효소촉매반응에 관여하는 비범상 상호작용의 근원적 메카니즘 규명.

효소 작용 기작에 저장벽 수소결합 (LBHB) 및 aromatic-aromatic, aromatic-charge interaction, 또는 수소결합 networking의 역할을 이해하기 위해 본 연구팀이 확보하고 있는 ketosteroid isomerase(KSI) system을 이용하여 단백질 공학적인 연구방법과 구조생물학적 연구방법을 입체적으로 융합하기 위해 아미노산 변이를 통한 단백질 활성부위 변환, recognition switching , 삼차원

효소촉매반응에 관여하는 비범상 상호작용의 근원적 메카니즘 규명.

효소 작용 기작에 저장벽 수소결합 (LBHB) 및 aromatic-aromatic, aromatic-charge interaction, 또는 수소결합 networking의 역할을 이해하기 위해 본 연구팀이 확보하고 있는 ketosteroid isomerase(KSI) system을 이용하여 단백질 공학적인 연구방법과 구조생물학적 연구방법을 입체적으로 융합하기 위해 아미노산 변이를 통한 단백질 활성부위 변환, recognition switching , 삼차원구조 결정, 기질 복합체 삼차원 구조 결정, 동력학적 촉매 실험, 평형상태 실험을 통한 에너지 프로파일 연구, 양자 통계 역학적 해석을 통한 이론적 접근 등을 수행하였다. 효소-기질, 효소-중간산물유사체, 그리고 효소-산물 복합체의 삼차원 구조를 X-ray crystallograpy에 의해 얻은 결과를 다른 분광학적 방법과 결부시키기 위하여 NMR 및 UV-, CD, 혹은 fluorescence spectroscopy법을 이용해 이들의 결합 mode를 분자수준에서 일관성있게 설명할 수 있는 논리를 도출할 수 있었다.

본 연구에서는 KSI의 촉매 센타에 존재하는 비범상 상호작용이 연구를 통하여 촉매작용 뿐만 아니라 단백질 폴딩에도 비범상 상효 작용이 중요함을 알 수 있었다. 또한, 효소 결합체에 대한 결정구조와 NMR 분석을 통하여 효소저해제들의 pKa 값이 효소 활성부위에서 크게 변한다는 증거를 확보하였다. 본 연구에서 얻어진 단백질 구조와 촉매 반응 그리고 폴딩 과정에서의 비범상 상호작용의 원리는 KSI 뿐만 아니라 생명체에 존재하는 많은 단백질에서 공통적인 motif 로 작용할 가능성이 많다.
아울러 향후 “어떤 메커니즘으로 단백질 촉매 작용과 폴딩이 일어나는데 어떠한 단백질의 구조적 모티프가 작용하는가?” 에 대한 중요한 연구시스템을 확보하고 연구기반을 마련하는데도 큰 의미를 부여 할 수가 있었다. Pseudomonas putida biotype B로부터 얻은 단백질 KSI의 폴딩과 안정성에 있어서 dimerization의 역할을 밝히기 위해 equilibrium 및 kinetic 분석이 수행되었고 효소의 비범상 상호작용과 연관성을 증명하였다. 또한 단백질 공학 기술과 접목해서서 특정 조건에서 고효율을 보이는 효소를 제작할 수 있었다.

Abstract ▼

Fundamental mechanism of extraordinary interactions in enzyme catalysis

Ketosteroid isomerase (KSI, EC 5.3.3.1) is one of the most proficient enzymes catalyzing an allylic isomerization reaction at a rate comparable to the diffusion-controlled limit by an intramolecular transfer of a proton.

Fundamental mechanism of extraordinary interactions in enzyme catalysis

Ketosteroid isomerase (KSI, EC 5.3.3.1) is one of the most proficient enzymes catalyzing an allylic isomerization reaction at a rate comparable to the diffusion-controlled limit by an intramolecular transfer of a proton. Two KSIs from different bacterial species, Pseudomonas putida biotype B and Comamonas testosteroni, have been studied extensively as a prototype to understand the catalytic mechanism of the allylic rearrangement. In order to understand the fundamental mechanism of KSIs, many biochemical experiments such as various spectroscopic methods, X-ray crystallography, enzyme kinetics, thermodynamics, modelling, and folding kinetics were accomplished. The analyses of mutational effects on catalysis, stability, folding, and structure make us reveal the extraordinary interaction and catalytic mechanism in enzyme reaction at the molecular level.

In this study, we demonstrated that extraordinary interactions of enzyme is important not only to enzyme catalysis but also to protein folding by extensive studies on the extraordinary interactions at the active site of enzyme. Besides, by analyzing crystal structure of enzyme/ligand complex and NMR spectrum of protein, we evidenced that the pKa value can be largely changed at the active site of enzyme. The principle obtained from the fundamental mechanism of extraordinary interactions in enzyme catalysis could contribute to the understanding of general enzyme mechanism and give the clue on universal motif in enzyme reaction and protein folding. We also accomplished equilibrium and kinetic experiments to elucidate stability and folding mechanism of KSIs. As a result, we demonstrated that dimerization of the monomer of KSI closely related to the extraordinary interactions.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문 ...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문 ...4
• 2. 영문요약문 ...5
• Ⅲ. 연구내용...6
• 1. 서론 ...6
• <연구목표>...6
• <제 1 세부과제; 단백질에 존재하는 비범상 상호작용의 역할 규명>...7
• <제 2 세부과제; 효소촉매 반응에 관여하는 비범상 상호작용의 구조적 연구>...7
• 2. 연구방법 및 이론 ...8
• <제 1 세부과제; 단백질에 존재하는 비범상 상호작용의 역할 규명>...8
• <제 2 세부과제; 효소촉매 반응에 관여하는 비범상 상호작용의 구조적 연구>...13
• 3. 결과 및 고찰 ...17
• (1) 비범상 수소결합 네트워크의 효소 촉매 기능...17
• (2) KSI의 폴딩과 안정성이 효소 촉매 작용에 미치는 영향...19
• (3) KSI의 전체 구조와 활성 부위의 환경이 촉매 작용에 미치는 영향 및 상관 관계...24
• (4) 효소에 내재하는 저 장벽 수소결합의 효소 촉매 반응에서의 기여도 측정...26
• (5) 방향성 잔기의 초결합 모티프...30
• (6) Aspartate의 pKa perturbation과 단백질 공학으로 응용...34
• (7) 효소 촉매 부위의 방향성 아미노산과 비범상 상호작용의 연관성...40
• (8) Catalytic base의 구조적 위치와 비범상 상호작용과의 관계...44
• (9) Dimeric interface의 안전성이 비범상 모티프에 미치는 영향...49
• (10) NMR을 이용한 효소 안정성에 관여하는 비범상 상호작용 규명...51
• (11) 생명현상에 중요한 역할을 하는 viral protease 에서의 비범상 상호작용...52
• 4. 결론 ...54
• 5. 인용문헌 ...55
• 6. 발표 논문 ...56