초록 ▼

본 연구의 궁극적 목표는 신경내분비의 분자적기구를 밝히고자 뇌 시상하부의 중요한 신경호르몬인 GnRH를 실험모델로 GnRH 유전자 발현에 있어서 RNA 스플라싱 기작을 생화학적, 분자생물학적 방법을 동원하여 종합적으로 연구함으로써 GnRH 신경세포 특이적으로 일어나는 GnRH 일차 전사체 스플라이싱의 원인을 규명하는 것이다. 본과제의 수행결과는 아래와 같다. 1. 1) 생식기능저하증 생쥐(Hpg mice)의 GnRH intron A의 제거율 감소와 ESE(exonic splicing enhancer)의 중요성을 in vivo에서 규

본 연구의 궁극적 목표는 신경내분비의 분자적기구를 밝히고자 뇌 시상하부의 중요한 신경호르몬인 GnRH를 실험모델로 GnRH 유전자 발현에 있어서 RNA 스플라싱 기작을 생화학적, 분자생물학적 방법을 동원하여 종합적으로 연구함으로써 GnRH 신경세포 특이적으로 일어나는 GnRH 일차 전사체 스플라이싱의 원인을 규명하는 것이다. 본과제의 수행결과는 아래와 같다. 1. 1) 생식기능저하증 생쥐(Hpg mice)의 GnRH intron A의 제거율 감소와 ESE(exonic splicing enhancer)의 중요성을 in vivo에서 규명하였고, 2) 정상적인 생쥐의 발생단계에 따른 GnRH intron A 제거율이 GnRH mRNA 발현양의 증가와 더불어 3주령 이후에 증가함을 확인하였다. 또한 3) 발생단계에 따른 스플라이싱 인자 중 Tra2${\alpha}$와 이에 상호작용할 것으로 기대되는 SRp30c 중 Tra2${\alpha}$가 사춘기 후에 발현이 증가함을 확인하였으며 ESE의 생리적 중요성을 탐색 규명하였다. 2. GnRH 신경세포 특이적 스플라이싱 인자의 생화학적 탐색과 번역 활성 억제의 분자적 기작의 규명의 결과로써 1) GnRH를 분비하는 GT1 신경세포로부터 고농도의 핵추출물을 분획/분리하였으며, 2) 분획물 중 ASP40-50 추출물에 GnRH intron A의 제거에 핵심적인 인자가 존재함을 확인하였다. 또한 3) intron A의 제거에 핵심인자가 Tra2${\alpha}$라는 SR 단백질이며 이것이 ESE4에 특이적으로 결합함을 확인하였으며, 더 나아가 4) GnRH-luciferase를 사용하여 in vitro transcription/translation에 있어서 intron A의 번역 효율 억제 효과를 확인함으로써 intron A에 의한 해독 억제가 intron A에 존재하는 14개의 ATG 염기서열에 기인함을 밝힘으로써 hpg 생쥐의 병인을 분자적으로 규명하였다. 3. GnRH 신경세포 특이적 스플라이싱 인자의 생화학적 탐색 및 이를 매개로 한 GnRH 스플라싱 조절기작 규명의 일환으로 1) 스플라이싱 복합체 중 Tra2${\alpha}$와 결합하는 것이 SRp30c임을 확인하였으며, 2) 탐색된 GnRH 특이적 스플라이싱 복합체 구성단백질을 baculovirus 시스템을 사용하여 과발현 및 정제하여 조절기작과 기능적 의의를 검증하였다. 이상의 연구결과는 시상하부 GnRH splicing 조절기작연구를 통해 신경내분비기작의 조절을 규명함으로써 내분비계 이상으로 인한 질환연구에 활용할 수 있다고 사료된다.

Abstract ▼

The present study aims to elucidate the molecular mechanism underlying the regulation of hypothalamic GnRH RNA splicing. The major findings are as follows: 1. We found that removal of GnRH intron A was decreased in hypogonadal (hpg) mice lacking of ESE (exonic splicing enhancer). At the developmenta

The present study aims to elucidate the molecular mechanism underlying the regulation of hypothalamic GnRH RNA splicing. The major findings are as follows: 1. We found that removal of GnRH intron A was decreased in hypogonadal (hpg) mice lacking of ESE (exonic splicing enhancer). At the developmental stage in the normal mouse, splicing rate of intron A and GnRH mRNA increased simultaneously and especially after the postnatal 3 weeks. Following puberty splicing facotrs, Tra2${\alpha}$ and SRp30c that could interact with Tra2${\alpha}$, were increasingly transcribed. Translational efficiency of intron A was confirmed by the in vitro transcription／translation using GnRH-luciferase reporter. These results indicate the physiological importance of ESE for RNA splicing of GnRH intron A. 2. To search the GnRH neuron-specific splicing factor and examine the molecular mechanism of transcriptional inhibition/activation, we provide evidence that critical factors in GnRH intron A excision contained in 40-50 fraction from ammonium sulfate-saturated pellets (ASP) of GnRH-producing GT1 cell line. Moreover, UV cross-linking and gel mobility shift analysis revealed that Tra2${\alpha}$, a 40-kDa SR protein, bound to the ESE4, indicating that Tra2${\alpha}$ may playa key role in excision of the intron A. In addition, we proved the evidence that start codon (ATG) in the mouse GnRH intron A region contributes to the inhibition of excision of the intron A. These results strongly suggest that 14 tandem repeated ATG sequences of the GnRH intron A could block the appropriate translation initiation at the down stream. Accordingly, the impairment of GnRH intron A splicing may be a molecular cause for the failure in GnRH synthesis in hpg mice. 3. Finally, yeast two hybrid screening using Tra2${\alpha}$ as bait yielded that SRp30c, another SR protein, specifically interact with Tra2${\alpha}$. Using the baculovirus over-expression system, several SR proteins were expressed and used for UV cross-linking and gel mobility analysis specifically bound to ESE4 in vitro. Thus Tra2${\alpha}$ specifically binds to the ESE4. Taken together, these results suggest that an understanding of the GnRH neuron-specific splicing machinery provides an important insight into the molecular mechanism of GnRH gene regulation and consequently application to the neuroendocrine disorders in mammals.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 보고서 초록...3
• 요약문...4
• 목차...7
• SUMMARY...8
• CONTENTS...9
• 제1장 연구개발과제의 개요...10
• 제2장 국내외 기술개발 현황...11
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...12
• 1. 연구방법 및 내용...12
• 2. 연구수행 결과...15
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...42
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...44
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술...45
• 제7장 참고문헌...46