초록 ▼

1. 조혈 줄기세포 및 간충직 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)를 이용한 방사선 손상회복 세포치료기술개발 가. 방사선 조사 후 골수의 재생능 및 기질세포의 영향 1) 방사선 조사 후 골수 재생능의 단계별 분석 단기성 줄기세포에 대한 방사선 조사의 영향은 비장 집락군을 형성할 능력이 있는 세포를 동정하는 colony forming unit-spleen (CFU-S) 의 수적 변화를 방사선 조사 후 추적하였으며, 전구세포 및 oligo-lineage progenitor cell 들에 미치는 영 향은 semi-s

1. 조혈 줄기세포 및 간충직 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)를 이용한 방사선 손상회복 세포치료기술개발 가. 방사선 조사 후 골수의 재생능 및 기질세포의 영향 1) 방사선 조사 후 골수 재생능의 단계별 분석 단기성 줄기세포에 대한 방사선 조사의 영향은 비장 집락군을 형성할 능력이 있는 세포를 동정하는 colony forming unit-spleen (CFU-S) 의 수적 변화를 방사선 조사 후 추적하였으며, 전구세포 및 oligo-lineage progenitor cell 들에 미치는 영 향은 semi-solid methyl-cellulose에서 집락을 형성하는 능력을 측정하는 colony forming cell (CFC) assay를 통하여 동정하였음. 골수기질세포에 대한 영향은 방사선 조사된 골수세포를 채취하여, 10 - 14일간기질세포를 배양하여, 집락군 (CFU-F)를 형성하는 세포들의 변화를 crystal violet 염색을 통하여 추적하였음. 2) 골수재생과정에서의 기질세포의 역할 및 방사선 조사에 의한 기질세포 기능변화 분석 방사선 조사에 의한 골수기질세포의 재생 역학 분석 골수 재생 중 기질세포의 역할 분석 나. 이형조직항원 및 Fas 유전자 이식으로 면역관용유도 물질 개발 1) 쥐 MHC (조직항원) 및 FasL CD40 유전자 발현 Retroviral Vector의 벡터 제작 Class I 및 II MHC Type이 상이한 세 가지 mouse strain을 구입하여 breeding 하여 retroviral vector 외에 유전자의 발현벡터를 조사하였다. 2) 생쥐 골수세포에의 유전자 이식 조건 확립 골수세포로의 효과적인 유전자전달 기술의 확보를 위해 total bone marrow, 혹은 lineage marker-positive 세포를 제거한 분화초기세포를 분리하여 cytokine 존재 하에서 유전자 전달 효율을 비교 검토하였다. 3) 생쥐모델에서의 골수이식이 이형 MHC 를 지닌 조직거부에 미치는 영향 골수이식의 이식 조직에 대한 관용성 유도 효과를 검증하고 이식 protocol을 확립하기 위하여 Balb/c mouse에 C57BL6 골수를 이식하고 골수를 이식한 경우와 control 사이에 이식된 피부조직에 대한 거부반응 Kinetics의 차이를 분석하였다. 다. 손상조직 미세환경에서 간충직 줄기세포 가동화 인자 추적 골수의 간충직 줄기 세포(mesenchymal stem cell)가 손상된 조직의 회복에 관여하는지를 검토하고, 이 과정에 골수로부터 간충직 세포를 혈중으로 유리시키는 기능을 가진 인자들을 PCR과 ELISA로 분석하여, 관련 후보 인자를 동정하고, 이 후보인자가 간충직 줄기세포가 골수로부터 유리(mobilization)되어 혈중으로 이동하여 손상 조직에 침착하여 손상 조직 회복에 에 관여하는지를 분석하였다. 라. 간충직 줄기 세포의 유리에 대한 substance-p의 역할 규명1) MMP activityIn vitro상에서 간충직 줄기세포에 substance-p를 처리하여 MMP 활성도가 증가하는지를 gelatin zymography로 확인, MMP 분비 및 TIMP-1의 분비, MT1-MMP의 발현을 면역블롯팅으로 확인하였다.2) 세포 이동Millicell(insert plate)을 이용하여 간충직 줄기세포의 하층부에substance-p를 농도별로 처리하여 간충직 줄기 세포가 농도 의존적으로이동하는지 확인하였다.마. 간충직 줄기 세포의 유리에 대한 substance-p의 신호 전달Substance-P 100 nM을 간충직 줄기세포에 처리 후 Erk 활성화에 미치는영향을 조사하였다.바. Substance-p 혈중 내 injection에 의한 CD29+ cell의 혈중 유리골수로부터 간충직 줄기 세포의 혈중 유리에 대한 영향을 알아보기 위해알칼리 화상 모델 생쥐의 꼬리 부분 정맥에 0.1 n/g(65ng/g)의 substance-P를 주사, 24 시간 후 전체 혈액을 취하여 그 중 단핵구를 분리하고, 간충직 줄기세포의 표지자인 CD29 (integrin b1)에 대한 면역 염색을 실시하여혈중에 존재하는 간충직 줄기세포의 비율을 확인 하였다.사. substance-p iv injection의 손상 치유 촉진 효과알칼리 화상을 입힌 뒤, substance-P를 주사하지 않은 토끼와 주사한 토끼의 각막을 비교하여 substance-p가 상처 치유에 영향을 미치는지 확인하였다.2. 줄기세포 및 서방형 성장인자 전달을 이용한 위장관계 손상 치료기술가. 위장관 줄기세포의 동정 및 최적 배양 조건 수립일차 분리 배양 된 crypt cell의 기저부 세포에서 발현되는 후보 표지자들을 면역 염색으로 확인.세포외 기질과 성장인자의 조합으로 세포 배양의 조건을 최적화.나. 위장관 조직 재생의 최적 성장인자 병합 조건 수립, 서방형 담체 개발1) 방사선 조사 위장관계 손상 회복 모델생쥐에 전신 피폭의 방사선 dose를 다양하게 조사 후 위장관 조직을whole mount 염색하여 위장관 손상 및 재생을 확인하기에 적정 dose를 수립하였다.2) 위장관 조직 재생의 최적성장 서방형 담체 개발생체적합성이 뛰어난 젤라틴을 이용하여 pH 에 따른 방출거동이 다른 두종류의 담체 개발다. 조직재생의 지지체의 제조 조건의 수립을 위한 nanopattern 제조 및 세포외기질 성분의 선택적 코팅법 개발1) Gene activated matrix (GAM) 물질 개발2) 나노 스탬프(nano stamp) 제조3) 친수성/소수성질이 다른 두 종류의 알칸치올유도체[o-Mercapto-oligo(ethylene glycol)] 합성을 통한 패턴확인으로 선택적 코팅법을 개발3. 성체줄기세포의 교차 분화를 통한 방사선 손상 치료기술 개발가. 성체 조직에서 교차 분화 가능한 잔여 줄기세포 탐색성인줄기세포의 탈분화능 및 다분화능이 보고 되면서 다분화능 자가 줄기세포를 이용한 다양한 조직 재생의 가능성에 대한 기대가 증가하게 되었고, 최근에 진피에 존재하는 skin derived precursor cells (SKPs)이 보고되었다. 이들 세포는 in vitro에서 근육, 신경, glial 세포로 분화가 가능함이 입증되었다. 이와 같은 보고는 인체의 가장 큰 면적을 차지하며, 체외에 있어 생검이 용이한 피부 조직의 multi-potent stem cell source로서의 가능성을 탐색하였다.나. 조직 특이적 분화 유도 조건 수립DMEM과 F-12 가 3:1 로 혼합된 배지에 B27, 40 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml LIF를 첨가하여 배양 후 다양한 분화 유도 조건을 제공하여 신경줄기세포의 표지자인 nestin 발현 여부 및 dendrite형성, 신경세포 표지자인 bIII tubulin, post-mitotic 신경세포 표지자인 MAP2, astrocyte 표지자인 GFAP 발현 여부를 비교 관찰하였다.

Abstract ▼

1. Cell therapy using haematopoietic stem cell and bone marrow stroma cell A. Regeneration capacity of bone marrow and marrow stroma cell implication to bone marrow regeneration after irradiation 1) Grade analysis of bone marrow regeneration after irradiation Radiation effect on bone marrow was anal

1. Cell therapy using haematopoietic stem cell and bone marrow stroma cell A. Regeneration capacity of bone marrow and marrow stroma cell implication to bone marrow regeneration after irradiation 1) Grade analysis of bone marrow regeneration after irradiation Radiation effect on bone marrow was analyzed by counting both colony forming unit-spleen (CFU-S) and colony forming cell (CFC) on semi-solid methyl-cellulose. After collecting irradiated bone marrow, primary cultured marrow stroma cells were analysed for CFU-F (crystal violet). 2) Effects of marrow stroma cell on bone marrow regeneration Kinetic assay of Regeneration capacity of marrow stroma cells after irradiation Analysis of the role of marrow stromal cells during bone marrow regeneration B. Immune tolerance induction using histocompatibility antigen and FAS gene delivery 1) Construction of retroviral vector expressing MHC and FasL CD40 gene 2) Optimization of gene delivery to mouse bone marrow 3) Analysis of effects of bone marrow transplantation of allogenic MHC antigen in mouse model (Graft-versus-host reaction) C. Identification of mobilization factor of mesenchymal stem cell Identify candidate factors to mobilize mesenchymal stem cells among factors expressed in wound environment. D. Biological effects of substance-p on mesenchymal stem cell mobilization from bone marrow 1) MMP activity Expression of MMP-2, -9, MT1-MMP, TIMP-1 and MMP activity (zymography) of mesenchymal stem treated with substance-p. 2) Cell migration We investigated whether substance-p induced mesenchymal stem cell migration/invasion using Millicell (insert plate). E. Substance-p induced signal transduction pathway of mesenchymal stem cells We analyzed Erk activation of mesenchymal stem treated with substance-p. F. Effect of substance-p on mesenchymal stem cell (CD29+ cell) mobilization to the blood We analyzed whether the proportion of CD29+ cells increased in the blood by intravenously injected substance-P (0.1 nmole/g(65ng/g)) in the mouse alkali burn model. G. The wound healing effect of substance-p (iv injection) In the rabbit alkali burn model, we investigated whether substance-p affected the rate of wound healing. 2. Remedy of damaged gastrointestinal tissue using stem cell therapy and sustained growth factor delivery system A. Identification of GI stem cell and optimal culture condition We immuno-stained whole crypts and intestine tissue sections with candidate stem cell markers. Primary culture condition of intestinal epithelium was optimized by the combination of extra-cellular matrix and cytokines. B. Sustained growth factor delivery carrier, and combined condition for gastrointestinal tissue regeneration 1) Whole body irradiation animal model 2) Development of gelatin matrices as drug carrier for gastrointestinal tissue regeneration C. Development of selectively nano-patterned ECM coating method for tissue engineered scaffolds 1) Gene activated matrix 2) Synthesis and identification of o-Mercapto-oligo(ethylene glycol) derivatives 3) Selectively ECM coating method using nano-patterned PDMS stamps 3. Transdifferentiation of adult stem cell to the therapeutic target cells A. Identification of rudiment stem cells in adult tissues Adult stem cells have been reported to have tremendous capability of differentiation, equal to embryonic stem cell, multipotency and pluripotency. A recent report showed that the unknown population of skin derived precursor cells (SKPs) in the skin of postnatal animal and man. Those cells were able to differentiate into myocytes, neurons, glial cells in vitro. Skin has advantages over other tissues, in that it has a massive size and easy to obtain. B. Establishment of tissue-specific differentiation condition for SKPs Neural precursor cells were induced by the following conditions as DMEM : F-12 (3:1), B27, 40 ng/ml of bFGF, 20 ng/ml of EGF and 20 ng/ml of LIF. Neural precursor cells were further induced to differentiate into various lineages of neuronal and astrocytes and identified by the expression of nestin, bIII tubulin, MAP2 (post-mitotic neuronal marker), GFAP (astrocyte marker) and morphological characteristics (dendrite formation).

목차 Contents

• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ...7
• 제 1 절 연구개발의 경제.사회.기술적 중요성 ...7
• 제 2 절 연구개발의 기술적 측면 ...8
• 제 3 절 연구개발의 경제, 산업적 측면 ...8
• 제 4 절 연구개발의 사회문화적 측면 ...9
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ...9
• 제 1 절 지금까지의 연구개발 실적 ...9
• 1. 선진국 연구개발동향 및 기술수준 ...9
• 2. 국내기술개발동향 및 기술수준 ...9
• 제 2 절 현기술상태의 취약성 ...10
• 제 3 절 앞으로의 전망 ...10
• 제 4 절 국내에서 연구개발 하는 대신 기술도입 가능성 ...10
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ...11
• 제 1 절 조혈 줄기세포 및 간충직 줄기세포(Mesenchymal stem cell; MSC)를 이용한 방사선 손상 치료기술 개발 ...11
• 1. 조혈줄기세포의 최적 확장 기술 개발 및 방사선 조사 후 골수 재생능의 단계별 분석, 골수 재생과정에서의 기질세포의 역할 및 방사선 조사에 의한 기질세포의 기능 변화 분석...11
• 2. 이형조직항원 및 Fas 유전자 이식으로 면역관용유도 물질 개발 ...13
• 3. 손상조직미세환경에서 간충직 줄기세포(mesenchymal stem cell) 가동화 인자 추적 ...13
• 4. 간충직 줄기 세포의 유리에 대한 Substance-p의 역할 규명 ...14
• 5. 간충직 줄기 세포의 유리에 대한 Substance-p의 신호 전달 ...14
• 6. substance-p iv injection에 의한 CD29 + cell의 혈중 유리 증가 ...14
• 7. Substance-P iv injection의 손상 치유 촉진 효과 ...15
• 제 2 절 줄기세포 및 서방형 성장인자 전달을 이용한 위장관계 손상 치료기술...15
• 1. 위장관 줄기세포의 동정 및 최적 배양 조건 수립 ...15
• 2. 위장관계 조직 재생의 최적 성장인자 병합 조건 수립, 서방형 담체 개발...16
• 3. 조직재생 지지체의 제조 조건의 수립을 위한 nanopattern 제조 및 Nanopattern 위의 ECM 성분의 선택적 코팅법 개발...17
• 제 3 절 성체 줄기세포의 교차 분화를 통한 방사선 손상 치료 기술 개발 ...20
• 1. 성체 조직에서 교차 분화 가능한 잔여 줄기세포 탐색 ...20
• 2. 조직 특이적 분화 유도 조건 수립 ...21
• 제 4 장 연구개발 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ...21
• 제 1 절 최종 목표 및 연차별 목표 ...21
• 1. 최종목표 ...21
• 2. 연차별 목표 ...21
• 제 2 절 관련 분야에의 기여도 ...21
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...22
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ...22