초록 ▼

1. 마우스를 이용한 적응응답반응 유도과정에서 HSP25 및 HSP70의 관여성 확인
방사선에 민감한 동물종인 C57BL6 및 내성 동물종인 C3H 마우스를 이용한 저준위 방사선 (0.05 Gy) 전조사에 의한 적응응답반응이 일어나는가를 관찰하였다.
1) 실험군의 결정 : 각 군당 20마리씩 배정하여 저준위 방사선 단독군 (0.05Gy), 저준위 및 고준위 방사선 병용 치치군 (0.05Gy+6Gy), 고준위 방사선 단독군 (6Gy)로 군을 분리하고 1주일에 3번 저준위 방사선을 조사하고 마지막 조사일 다음날 고준위 방사선

1. 마우스를 이용한 적응응답반응 유도과정에서 HSP25 및 HSP70의 관여성 확인
방사선에 민감한 동물종인 C57BL6 및 내성 동물종인 C3H 마우스를 이용한 저준위 방사선 (0.05 Gy) 전조사에 의한 적응응답반응이 일어나는가를 관찰하였다.
1) 실험군의 결정 : 각 군당 20마리씩 배정하여 저준위 방사선 단독군 (0.05Gy), 저준위 및 고준위 방사선 병용 치치군 (0.05Gy+6Gy), 고준위 방사선 단독군 (6Gy)로 군을 분리하고 1주일에 3번 저준위 방사선을 조사하고 마지막 조사일 다음날 고준위 방사선을 조사하였다. 고준위 방사선 조사 다음날 각군당 10마리씩 부검하여 임파구를 분리, 임파구에RNA을 분리하여 Heat Shock Protein (HSP) 유전자 발현을 측정하였고 나머지 10마리는 생존율을 관찰하였다.
2) 방사선 조사: 조준위 방사선 (1 cGy) 조사에는 자체 제작한 저준위 방사선 조사기로 $^{137}$Cs 감마선을 분당 0.143 cGy로 조사하였다. 고준위의 경우 $^{60}$Co 원격 치료장치 (Teratron-780, AECC)를 사용하여 선량률 119.7 cGy/min로 조사하였다.
3) 임파구의 분리 : 마우스에서 비장을 분리한 후 mincing하여 단일세포로 만들었다. phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척한 RNA를 분리하였다.
4) RNA의 분리 및 Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (PCR): 비장서포로부터 5M guanidine thiocyanate 용액을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 1% agarose gel상에서 순도를 확인하였다. 각각이 NA 20${\mu}$g를 취하여 6% formaldehyde가 포함된 1% agarose gel에 전기영동을 하였다. 확인된 RNA를 Rnase-free DNase를 처리하여 시료에서 DNA를 제거하였다. RNA 0.2${\mu}$g에 RT buffer 4.0${\mu}$l, DEPC 처리된 H$_2$O 9.4${\mu}$l, dNTP (250 ${\mu}$M) 1.6 ${\mu}$l, 3' primer (H-T$_{11}$G or H-T$_{11}$A or H-T$_{11}$C) 2${\mu}$l을 넣고 65$^{\circ}$C에서 5분 반응시킨 후 MMLV reverse transcriptase 1 ${\mu}$l을 넣고 37$^{\circ}$C에서 60분 반응시켰다. 75$^{\circ}$C에서 5분 반응시켜 효소를 비활성화시켰다. 제작된 cDNA 시료 2${\mu}$l에 H$_2$O 9.2${\mu}$l, 10X PCR buffer 2${\mu}$l, dNTP(25${\mu}$M) 1.6 ${\mu}$l, 각각의 HSP primer 2${\mu}$l, Taq polymerase 0.2 ${\mu}$l을 넣고 94$^{\circ}$C에서 30초, 40$^{\circ}$C에서 2분, 72$^{\circ}$C에서 30초를 40번 반복한 후 72$^{\circ}$C에서 5분 반응시켰다. 반응 후 시료 3.5${\mu}$l에 loadng dye 2${\mu}$l을 섞고 80$^{\circ}$C에서 2분 방치한 후 1% denaturing polyacrylamide gel에서 변화도니 발현양상을 관찰하였다.
5) Apoptosis 측정 : 방사선 조사 후 세포를 3.7%의 formaldehyde 용액에 20 분 동안 고정시킨 다음 PBS 용액으로 세척하였다. 암 조건하에서 4 ${\mu}$g/ml 농도의 Hoechst 용액에 10분간 염색한 후 형광현미경으로 관찰하여 DNA fragmentation 이 일어난 세포를 계수하여 비교하였다.
2. HSP70 transgenic 및 Knock outmouse 마우스 확립 및 적응응답반응의 확인
1) 임파구의 분리 : 마우스 비장에서 Ficoll-Hypacque를 이용하여 임파구를 분리하였다.
2) 방사선 조사: 저준위 방사선 (1 cGy) 조사에는 자체 제작한 저준위 방사선 조사기로 $^{137}$Cs 감마선을 분단 0.143 cGy로 조사하였다. 고준위의 경우 $^{60}$Co 원격 치료 장치 (Teratron-780, AECC)를 사용하여 선량률 119.7 cGy/min로 조사하였다.
3) Apoptosis 측정 : 방사선 조사 후 세포를 3.7%의 formaldehyde 용액에 20 분 동안 고정시킨 다음 PBS 용액으로 세척하였다. 암 조건하에서 4 ${\mu}$g/ml 농동의 Hoechst 용액에 10분간 염색한 후 형광현미경으로 관찰하여 DNA fragmentation 이 일어난 세포를 계수하여 비교하였다.
1) Small-Heat Shock (HSP25) 또는 Inducible HSP70 Protein을 분비하는 세포주의 확립 : Murine L929 세포를 10% fetal bovine serum (FBS, GIBCO, Gaithersburg, MD, USA)와 100 units/mL penicillin, 100 ${\mu}$g/ml streptomycin이 첨가된 DMEM 배지 (GIBCO) 에서 37$^{\circ}$C (5 % CO$_2$ 95 % air) 배양조에서 배양하였다. HSP25 의 endogenous expression이 거의 없는 mouse fibrolast L929 세포에 murine HSP25의 complete genetic sequence가 포함된 pBC vector (Stratagene, La Jolla, Co. USA)를 이용하여 Lipofection 법 (GIBCO)으로 transfectant를 제조하여 [24] clone #6 와 #8을 얻었다 [22, 23]. HSP70는 NIH3s 세포에 과발현 시켰으며 inducible HSP70만이 과발현되게 만든 vector를 사용하였다. 배양조건은 L929 세포와 동일하였다.
2) HSP25 antisense, IkB-dominant negative 및 MnSOD expression vector 제작: HSP2의 antisense 발현 vector는 murine HSP25 antisense sequence가 포함된 pSVK3 vector를 이용하여 transfectant를 제조하였다. IkB dominant negative mutant 세포는 HSP25가 과발현된 세포에 IkB dominant ngative mutant 된 sequence 가 포함된 retroviral vector sytem을 이용하여 transfectant를 제조하였다. MnSOD의 transfectant는 human MnSOD cDNA를 L929 세포에 transfection 시켰다.
3) Colony-forming assay
세포를 6mm dish에 dish당 500개를 깔아준 후 7~14일정도 배양시킨다. 그 후 생성된 colony 들은 고정시킨 후 (75% methanol 과 25% acetic acid) 0.4% trypan blue로 염색하여 그 colony 수를 측정하였다.
4) TNF-alpha Assay
세포 배양액중의 TNF-alpha를 conjugate 와 substrate로 상온에서 반응시킨 후 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay reader로 450 nm에서 흡광도 (OD)를 측정하였다 (Multiskan, Labsustems, Finland).
5) Apoptosis detection
세포를 glass slides에 깔아준 다음, 방사선 조사를 하였다. 이를 70% ethanol로 고정시키고, 다시 PBS로 수세한 후, 형광을 띠며 DNA 에 결합하는 염색인 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI 1 ${\mu}$g/mL) 용액으로 30분 동안 상온 어두운 곳에서 염색하였다. 그리고 염색된 핵의 모양은 형광 현미경 (Heochst No. 33258, Japan) 하에서 ultraviolet excitration filter를 통해 관찰하였다.
6) Electron microscopy
세포를 2 % paraformaldehyde 와 2.5% glutaraldehyde의 0.1 M sodium cacodylate-HCI (pH 7.4)의 buffer에 하룻밤동안 4 $^{\circ}$C 에서 고정시킨 후 osmium-tetroxide dehydrated 와 isoamyl-aceate를 사용하여 염색하였다. 이를 전자현미경을 (Hitach E-1030, Hitachi S-520, Japan) 통하여 관찰하였다.
7) MnSOD activity assay
세로를 1.33 mM diethylentriamine pecta acetic acid (DETAPAC)가 포함된 0.05 M potassium-phosphate buffer (pH7.8)에 현탁된 차가운 상태에서 초음파 (Sonifier 250, BRANSON, USA) 처리한 (Level 2, 3sec, 7sec interval, 6 times) 다음 14,000xg 에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 단백질 분획으로 하였다. 이를 50 ${\mu}$g씩 정량 하여 SDS가 포함되지 않은 non-denaturing 10% polyacrylamide gel에 전기 영동 하였다. 그 후 Nitro Blue Tetrzolium (2 mg/mL) 와 riboflavin (10 mg/mL)을 어두운 곳에서 15분 동안 염색한 후 형광 빛에 노출시켜 SOD band를 확인하였다.
8) Polyacryamide gel electrophoresis and western blot
세포 내 여러 가지 단백질의 양상을 알아보기 위하여 각 시간에 따라 세포 추출물을 얻어, SOD가 함유된 polyacrylamide gel 전기영동 (SOD-PAGE)를 실시하였다.
전기영동 후 nitrocellulose filter membrane 에 100V에서 1시간동안 transfer하고, 5% 탈지 분유를 함유한 PBS로 blocking 한 후, primary antibody 와 secondary antibody를 각각 반응시키고 0.05 % tween 20이 함유된 PBS로 세척한 후 Chemiluminescence reagent kit (ECL, Amersham Intenational, USA)를 이용하여 X-ray film (Eastman Kodak Co, USA)을 감광시켜 발현된 단백질을 확인하였다.
9) Northern blot
세포에서 total RNA를 TRI$^{TM}$ reagent (MRC, Cincinati OH, USA)를 사용하여 추출하였다. 추출된 RNA 는 65$^{\circ}$C에서 15분간 변성시킨 후, 1% agarose-formaldehyde gel에서 1시간동안 전기영동을 하였다. 그 후, nylon membrane filter 에 transfer를 하고 여기에 $^{32}$P 가 표지된 probe를 이용하여 hybridization을 42$^{\circ}$C에서 16~24시간동안 시키고, 이것을 2x Sodium Sodium Citrate (SSC), 1xSSC, 0.1xSSC로 65$^{\circ}$C에서 세척한 다음 X-ray film을 감광시켰다. Probe는 human MnSOD full-length cDNA (National Institute of Radiological Science, Dr. Makoto Akashi, Japan)를 사용하였다.
10) Reverse transcription PCR (RT-PCR)
세포에서 total RNA를 얻기 위하여 TRI$^{TM}$ reagent를 사용하였고, 얻어진 total RNA를 주형을 cDNA를 합성하는 효소인 AMV 역전사 효소 (Promega, Madison, WI, USA)와 1x RT buffer, 1 ${\mu}$M dNTP, 2.5 U RNasin, 1 ${\mu}$g의 total RNA를 Mixture로 만들어 37$^{\circ}$C에서 1시간동안 배양시켜 cDNA를 만든다. 이 cDNA를 원하는 측정한 primer (Stratagene, Lajolla CA, USA)로 PCR 방법으로 증폭시켜 2% agarose gel에서 전기영동을 한 후, ethidium bromide로 염색하여 확인하였다.
11) Electrophoresis mobility shif assay (EMSA)
먼저 배양된 세포를 PBS (pH 7.4)로 세척하고, buffer A (10 mM HEPES, 10 mM KCI, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 0.5% Nonidet P-40)에 현탁하여 4$^{\circ}$C에서 15분간 방치한 후 14,000xg 에서 30초간 원심 분리하여 상등액을 세포질분획으로 하였다. Nuclear pellet을 다시 buffer B (20 mM HEPES, 20 % glycerol, 0.42 M NaCi, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA)에 현탁한 다음 4$^{\circ}$C에서 15분간 vortexing 한 후 14,000xg 에서 20분간 원심 분리하여 핵분획을 얻었다. NF-${\kappa}$B 가 결합하는 consensus sequence oligonucleotide (5-AGT TGA GGG GAT TTT CCC AGG C-3)의 5 end (Santa Cruze Biotechnology. Inc. California, USA)에 [${\gamma}$-$^{32}$P] ATP를 이용하여 T4 polynucleotuide kinase 로 방사능 표지를 하고, 10~20 ${\mu}$g의 핵분획을 5x gel shift buffer (50 mM Tris-pH 7.5, 250 mM Nacl, 2.5 mM DTT, 5mM MgCl$_2$, 20% glycerol)와 함께 1${\mu}$g poly [dl-dC] 와 방사능 표지가 된 oligonucleotide를 첨가하여 실온에서 30분간 반응하였다. 반응한 후 8% non-denaturing polacrylamide gel에서 전기영동하여 autoradiography로 확인하였다. Super-shift assay를 위해서는 핵분획에 NF-${\kappa}$B의 subunit인 p65에 대한 항체를 미리 넣어 42$^{\circ}$C에서 20분간 반응시킨 후 위의 과정과 동일하게 실험하였다.
12) 세포주기 조절에 관여하는 단백질의 발현 측정
Vector control만 transfection 시킨 세포와 hsp70 유전자를 transfection 시킨 세포를 lysis 용액 (120 mM NaCl, 40 mM Tris (pH 8.0), 0.1% NP40)으로 1 시간 동안 처리하여 단백질만 추출한 다음 전기 영동상에서 분리한 후 western blot analysis를 실시하였다. 세포주기에 관여하는 단백질의 발현을 알아보기 위하여 mouse monoclonal anti-Cdc2, -p53, -cyclin B1 antibody (Santa Cruze Biotechnology, Inc., Santa Cuze, CA)와 rabbit polyclonal anti-CDK2, -CDK4, -cyclin D1, D2, A, (Santa Cruze Biotechnology) E (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), -PCNA, -Bcl2, -p27 antibody (Santa Cruze Biotechnology)를 1:1000으로 희석하여 사용하였다. 또한 Rb family의 변화를 보기 위하여 mouse monoclonal anti-Rb (Pharmingen, San Diego, CA), -p107, -p130 (Santa Cruze Biotechnology)를 1:1000으로 희석하여 사용하였다.
13) Co-Immunoprecipitation : 단백질을 추출한 후 Lysis buffer속에서 primary antibody와 반응하고 이어서 첨가된 protein A-sepharose에 primary antibody를 매개체로 결합하게 만든다. 이어 lysis buffer로 washing을 5회 정도 반복하였고 순수 분리된 단백질을 SDS-sample buffer로 denaturation한 후 SDS-PAGE로 해리하였다. Nitrocellulose Membrane에 transfer 한 후 원하는 protein에 대한 항체로 western blotting하여 그 protein과 interaction하는 protein을 검출하였다.
14) Immune Complex Kinase Assay: 단백질을 추출한 후 Immunoprecipitation을 실시하였다. Precipitation된 protein A-Sepharose beads를 lysis buffer로 3회 washing 한 후 다시 kinase buffer (20mM Tris, pH7.5, 4mM MgCl2)로 2회 washing하였다. Beads를 2X kinase buffer로 resuspension하고 3 uCi의 $^{32}$P-ATP와 substrate (2 ug)를 첨가하여 37C 30분간 반응하였다. 순수 분리된 단백질을 SDS-sample buffer로 denaturation한 후 SDS-PAGE로 해리 하였다. Gel dryer를 이용하여 건조한 후 autoradiography하였다.
15) 세포주기 측정 : 세포를 trypsin 처리한 후 70% ethanol에 하룻밤동안 고정시켜 둔다. Propidium iodide 형광시약을 DNA를 염색한 후 flowcytometry를 실시하여 G1, S, G2/M phase 변화를 관찰하였다.

Abstract ▼

Low doses of ionizing radiation can produce a stimulatory effect and induce adaptive responses to the harmful effects of subsequent high-dose radiation exposure. Several recent studies showed that adaptive responses were observed in chromosome aberrations, cell survival, sister chromatid exchanges,

Low doses of ionizing radiation can produce a stimulatory effect and induce adaptive responses to the harmful effects of subsequent high-dose radiation exposure. Several recent studies showed that adaptive responses were observed in chromosome aberrations, cell survival, sister chromatid exchanges, micronuclei, mutation and neoplastic transformation. Mechanisms and conditions for adaptive response to radiation have not yet been clarified, although one possible explanation relates to the induction of DNA repair processes in response to low-doses of around 0.01 Gy. The induction of new proteins in response to low-doses comes from the experimental support for this explanation. Our previous data showed that when preirradiated with 1 cGy, normal cells showed the adaptive response, but neoplastic cells did not. Reduced apoptosis by low dose preirradiation is an another mechanism for this effect. This adaptive response seems to be most prevalent in radioresistant cell lines, since several sensitive cell lines failed to show the increase in radioresistance beyond 0.5 Gy. It is well established that members of the HSP family function as molecular chaperones and assist in the intracellular folding of newly synthesized of proteins, and several investigators reported the induction of a HSP70 member protein during the adaptive response to oxidative stress with H202. This induction occurred during the pretreatment of cells with a low concentration of H202. Low doses of X-rays were found to activate the promoter of the human heat-shock protein HSP70B gene, whose transcription was silent in control conditions but was highly induced by heat shock treatment. Low dose of 4 cGy radiation which induced adaptive response also increased HSP70 mRNA. In addition, radioadaptive response by low dose ionizing radiation also involved induction of PBP74/mortalin/Grp75, a member of the HSP70 family. In the present study, we demonstrated that mouse RIF cells which did not induce HSP70 and HSP25, did not have an adaptive response after 0.01 Gy of low-dose preirradiation, whereas the thermoresistant TR cells which expressed inducible HSP70 and HSP25 showed the response. In addition, when inducible HSP70 and HSP25 were transfected into RI F cells, the cells acquired radioresistance suggesting that inducible HSP70 and HSP25 are important for the induction of the adaptive response and radioresistance.

목차 Contents

• 표지...1
• 최종연구보고서...2
• 제출문...3
• 총목차...4
• 제1부 저준위 방사선에 의한 적응응답반응의 기전 규명...5
• 요약문...6
• SUMMARY...21
• 목차...32
• 제1장 연국개발과제의 개요...33
• 제2장 국내외 기술개발 현황...35
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...37
• 제1절 연구내용 및 방법...37
• 제2절 연구 결과...43
• 제4장 연구개발 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도...81
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...82
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외 과학기술정보...83
• 제2부 정상조직 방사선 감수성 조절기전 규명...91
• 요약문...92
• SUMMARY...124
• 목차...131
• 제1장 연구개발과제의 개요...132
• 제2장 국내외 기술개발 현황...137
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...144
• 제1절 연구내용 및 방법...144
• 제2절 연구 결과...149
• 제4장 연구개발 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도...205
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...206
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외 과학기술정보...207
• 위탁 연구...212
• 제3부 방사선에 의한 발암 및 기형 모델 확립 및 기전 규명...269
• 요약문...270
• SUMMARY...279
• 목차...290
• 제1장 연구개발과제의 개요...291
• 제2장 국내외 기술개발 현황...293
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...297
• 제1절 연구내용 및 방법...297
• 제2절 연구 결과...302
• 제4장 연구개발 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도...324
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...325
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외 과학기술정보...327