초록 ▼

본 연구과제에서는 암의 형성 과정에서 Wnt signaling의 핵심 조절자인 Axin을 중심으로 Wnt signaling의 암의 형성에서의 역할을 규명하고자 하였음.
$\beta$-catenin의 level이 증가하면 암 억제 단백질인 APC의 mobility shift가 일어난다고 알려져 있음. 본 과제에서는 이 mobility shift가 casein kinase 1$\varepsilon$과 GSK3$\beta$와 다른 밝혀지지 않은 kinase에 의해 인산화가

본 연구과제에서는 암의 형성 과정에서 Wnt signaling의 핵심 조절자인 Axin을 중심으로 Wnt signaling의 암의 형성에서의 역할을 규명하고자 하였음.
$\beta$-catenin의 level이 증가하면 암 억제 단백질인 APC의 mobility shift가 일어난다고 알려져 있음. 본 과제에서는 이 mobility shift가 casein kinase 1$\varepsilon$과 GSK3$\beta$와 다른 밝혀지지 않은 kinase에 의해 인산화가 일어남을 밝히고, 이 과정에 기존의 결과와는 다르게 Axin이 필요하지 않음을 보임. APC의 인산화가 일어나면 $\beta$-catenin과의 affinity가 증가하고, 인산화 domain을 포함하고 있는 APC 절편들은 $\beta$catenin level의 억제 여부와 상관없이 Tcf/LEF reporter 활성을 감소함을 발견함. 이러한 실험 결과로부터 Wnt siganling의 조절을 위한 다음과 같은 모델을 제시함. 과도한 $\beta$-catenin level의 증가는 APC의 인산화를 유도시켜서 $\beta$-catenin과 결합하여 $\beta$-catenin이 cytoplasm에서 핵내로 이동하는 것을 억제함. APC에 의해 cytoplasm 있는 $\beta$-catenin은 $\beta$-catenin signaling에 의해 발현이 증가한 Axin-2에 의해 감소됨. 본 과제에서는 Smurf2가 Axin의 E3 ligase 임을 밝혔음. Axin을 inducible 하게 발현하는 HEK293-Axin stable cell line에 Smurf2를 도입하면 Axin의 ubiquitination이 증가하는 반면, mutant 형태의 Smurf2를 도입할 경우 ubiquitination의 증가를 볼 수 없었음. In vitro ubiquitination assay 결과도 동일한 결과를 얻었음. siRNA를 사용하여 Smurf2의 level을 낮추었을 경우 ubiquitination이 일어나지 않았음. 다양한 Axin deletion constructs를 사용하여, Smurf2와의 interaction domain, ubiquitination 및 down-regulation에 필수적인 domain을 결정하였음. Double thymidine blocking 실험을 통하여 Axin의 level이 cell cycle 이 진행됨에 따라 변화하며, siSmurf2를 사용할 경우 항상 Axin의 level이 일정하게 유지됨을 볼 수 있었음. 하지만, Wnt나 BIO에 의해 Axin의 level 감소되는 것은 siSmurf2가 억제하지 않음으로서 Smurf2는 cell cylcle이 진행되는 과정에서의 Axin의 level을 조절한다는 결론을 얻었음. 본 실험 결과는 세계 최초로 Axin의 E3 ligase를 발견했다는 중요성과 Wnt signaling의 이상에 의해 유발되는 암의 치료를 위한 새로운 therapeutic target을 제공한다는 의미가 있음.
본 연구결과는 분열세포에서 Axin의 분포의 조절은 암유발능을 가지며 mitotic kinase로서 중요한 기능을 하는 Aurora kinase에 의함을 밝혔음. 또한 Axin은 또 다른 mitotic kinase인 Polo-like kinase (Plk-1) 및 GSK3$\beta$의 세포내 분포 및 활성을 조절할 수 있어, Aurora kinase - Axin - Plk/GSK3$\beta$로 신호가 전달되는 축을 형성하게 된다. Plk-1 및 GSK3$\beta$의 활성과 Aurora kinase간의 신호전달 체계가 있음은 본 연구자가 아는 바에는 처음 밝혀진 사실임.
Aurora Kinase의 활성을 억제시키면, cytokinesis과정이 억제되어 분열 세포의 분리에 실패, 다핵세포를 형성하게 됨을 밝혔음. Axin을 과발현시킨 세포에서 Aurora kinase을 억제하면, actin을 기저로 한 cytoklnesis가 유발됨을 관찰하였음. Micortubule을 기저로 한 midbody 형성은 유발되지 않아 세포분리에는 실패하지만, Axin 과발현이 Rho 단백질를 통해 cleavage furrow와 contractile ring을 형성한다는 사실은 Axin이 cytokinesis 유발과 시작 시기를 조절함을 의미함. 이러한 결과는 microtubule과 결합능이 있는 Axin이 Plk - Rho신호전달을 이용 actin 구조 형성에 영향을 준다는 새로운 기전임.
종합적으로 Axin은 microtubule과 결합하며, actin의 구조에 영향을 줄 수 있고, 이러한 현상의 기본 기전은 Aurora kinase, Plk-1, 및 GSK3$\beta$와의 상호작용에 의함. 본 연구의 대상이된 단백질들이 직간접적으로 암발생 과정에 관계하는 요소라는 점을 고려하면, 이번 연구 결과가 암발생의 새로운 기전을 밝히는 초석이 될 수 있을 것으로 사려 됨.

Abstract ▼

In this study we have tried to show the role of Wnt signaling in cancer development, especially we tried focus on Axin, which is a key regulation of Wnt signaling.
It has been shown that accumulation of free $\beta$-catenin leads to mobility shift of adenomatous polyposis coli (APC) pr

In this study we have tried to show the role of Wnt signaling in cancer development, especially we tried focus on Axin, which is a key regulation of Wnt signaling.
It has been shown that accumulation of free $\beta$-catenin leads to mobility shift of adenomatous polyposis coli (APC) protein and that Axin facilitates this process. We show that the $\beta$-catenin-mediated mobility shift of APC is due to phosphorylation of two domains of APC by casein kinase 1$\varepsilon$/glycogen synthase kinase 3$\beta$ and unknown kinase(s), respectively. Interestingly, our results suggest that this process does not require Axin. The phosphorylated APC showed higher affinity to $\beta$-catenin in vivo, and fragments of APC containing the phosphorylated domains can inhibit $\beta$-catenin/Tcf-mediated reporter activity regardless of their ability to reduce the level of b-catenin. From our data we propose a new role of APC: accumulation of excessive cytoplasmic $\beta$-catenin induces phosphorylation of APC and the phosphorylated APC retains $\beta$-catenin in cytoplasm to prevent excessive $\beta$-catenin signaling. The retained $\beta$-catenin in cytoplasm by APC may be down-regulated by Axin2, which is induced by $\beta$-catenin/Tcf signaling.
We identified that Smurf2 (Smad Ubiquitination Regulatory Factor 2) is an E3 ligase for Axin. Transient expression of Smurf2 down-regulates the level of Axin in HEK293- Axin stable cell lines and increase the ubiquitination of Axin in vivo while a mutant form of Smurf2 neither reduces the level of Axin nor induces ubiquitination. In vitro ubiquitination assay shows that Smurf2 can directly increases the ubiquitination ofAxin. In addition, siRNA for Smurf2 blocks ubiquitinationof Axin. Using various Axin deletion constructs we could identify the essential domains for the interaction between Axin and Smurf2, the down-regulation and ubiquitination of Axin mediated by Smurf2. Double thymidine-blocking experiments showedthat the level of endogenous Axin fluctuates during cell cycle of 293T and HeLa cells. Interestingly, the fluctuation is blocked by the addition of siRNA for Smurf2. The degree of ubiquitination on Axin is not changed upon Wnt3a signaling or treatment of BIO which suggest that down-regulation of Axin upon Wnt signaling is not mediated by ubiquitin/proteasome pathway. Our data suggest that Smurf2 regulates the level of Axin by ubiquitin/proteasome pathway during cell cycle and Axin may play pivotal roles in the regulation of cell cycle.
Our study showed that Axin could bind microtubules and in mitosis, Axin was associated with mitotic spindles and centrosomes as its expression was increased. These results suggested of an important role of Axin and Wnt signaling in mitotic process.
Our results showed that regulation of Axin localization in mitosis was conducted by Aurora kinase activity which is known as mitotic kinase and oncogenic protein. Moreover, Axin could regulate another mitotic kinase, Polo-like kinase (Plk-l) and GSK3beta, suggesting of a novel signal transduction pathway; Aurora kinase -- Axin -- Plk-l/GSK3 $\beta$. This pathway, as far as our knowledge, may be demonstrated for the first time.
When Aurora activity was inhibited, mitotic cells failed to separate due to inhibition of cytokinesis, producing multinuclear cells. In case of Axin over-expressing cells, actin based cytokinesis still occurred in cells where Aurora activity was inhibited. These results indicated that Axin over-expression induced cleavage furrow and contractile ring formation through Rho activation, which suggested that Axin could regulate initiation and timing of cytokinesis.
Conclusively, Axin can bind to microtuble, which can regulate actin structural changes through involvement and interaction of Aurora kinase, Plk-1, and GSK3$\beta$. Since these proteins are involved in cancer development in direct or indirect way, our results may provide basic information to establish a novel mechanism for cancer development.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...3
• 목차 ...4
• 연구개발사업 최종연구개발과제보고서 요약문 ...5
• Project Summary ...7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ...9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...9
• 2. 총괄연구개발파제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ...9
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...11
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ...13
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ...23
• 6. 첨부서류 ...24
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ...30
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...31
• 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...33
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ...34
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...47
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ...48
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ...48
• 7. 참고문헌 ...49
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ...50
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...51
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...53
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ...57
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...69
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ...70
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ...70
• 7. 참고문헌 ...71