초록 ▼

○ 세부과제명: 식물체중 약리활성 물질 분리 기법 확립
- 후보식물체의 활성물질 탐색 및 이화학적특성 분석
가. TLC Pattern 조사 ; Bio-Xm을 에탄올로 추출, 비극성 용매인 헥산(Hexane)과 극성용 매인 에칠아세테이트(Ethyl acetate)를 전개용매로 하여 조사한 결과 약간의 비극성 조성(EA:Hx=4:6)에서 조성물의 분리도가 우수하였음
나. UV Profile 조사 ; 50% 메탄올을 이동상으로 역상컬럼에서 크로마토그래피 실시 200nm주위에 주로 피크가 용출되는 것으로 보아 탄화수소 화합

○ 세부과제명: 식물체중 약리활성 물질 분리 기법 확립
- 후보식물체의 활성물질 탐색 및 이화학적특성 분석
가. TLC Pattern 조사 ; Bio-Xm을 에탄올로 추출, 비극성 용매인 헥산(Hexane)과 극성용 매인 에칠아세테이트(Ethyl acetate)를 전개용매로 하여 조사한 결과 약간의 비극성 조성(EA:Hx=4:6)에서 조성물의 분리도가 우수하였음
나. UV Profile 조사 ; 50% 메탄올을 이동상으로 역상컬럼에서 크로마토그래피 실시 200nm주위에 주로 피크가 용출되는 것으로 보아 탄화수소 화합물과 알콜, 아민 화합물이 존재함을 유추할 수 있었음
다. IR 시행 결과,
- 모든 시료에서 공통적으로 aliphatic carbon과 케톤, C=C 작용기가 확인되었으며 Bio-X의 경우 C-N 작용기, Bio-X3의 경우 에스테르 작용기가 특징적으로 확인되었음
라. 후보식물체에 대한 정색반응
- Bio-X1, X2, X3, X4, Xm을 이용하여 알칼로이드 및 폴리페놀에 관한 정색반응을 시행한 결과 대부분의 시료에서 알칼로이드 및 폴리페놀이 검출되었으며 이는 IR data와 일치하였음
○ 후보식물체의 최적추출조건 설정
가. 활성성분 추출을 위해 물, 에탄올 및 메탄올로 시료 2g을 200ml의 추출용매를 이용, 온도는 용매의 끓는점, 4시간동안 환류추출하여 최적추출조건을 설정하였다
나. 이렇게 얻어진 초대추출물을 용매의 극성 변화에 따라 5가지 용매 핵산(Hx), 디에틸에테르(Et), 메틸렌 클로라이드(Mc), 에틸아세테이트(Ea), 부틸알콜(Bu)로 용매분배추출을 시행하여 효능평가에 이용하였다
○ 자생식물 유래 약리활성물질의 물리？화학적 성상 구명
- Bio-X1 유래 약리활성물질의 물리？화학적 성상 구명
- Bio-X1 유래 유효물질(Rf값 0.31)을 얻기 위해 에탄올-헥산 분배추출물을 실리카겔-60 칼럼(30*350mm), 이동상(헥산/에칠아세테이트/메탄올(3/3/1)), 유속 1.0-1.5ml/min으로 분획화하고, 다시 HPTLC silica gel plates (60F254, Merck)에 점적하여 n-헥산/에칠아세테이트/메탄올(3/3/1) 용액으로 전개, 5% 황산-메탄올로 유도체화하여 366nm에서 확인하였음
■ 유효물질 분획은 2-4/dinitrophenylhydrazine(DNP), ferric acid, dragendorff reagent, permanganate, p-anisaldehyde, ninhydrin 등을 이용하여 정색반응 한 결과 permanganate에서 노란색의 발색이 확인되어 불포화물질 또는 알콜류로 추정되었고, HPTLC scanner를 이용하여 순도를 확인한 결과 0.05 mg/ml 농도에서 90% 정도의 순물질로 확인되었음
■ 이 유효물질을 Sephadex LH20 칼럼 및 C18 Solid phase extraction 칼럼으로 더 정제하여 단일물질로 분리·정제하여 최종 확인을 위하여 1H NMR, $^13{C}$ NMR, GC/MS, TLC 시행, linoleic acid임을 밝혔음
■ 최종 분리된 활성물질의 확인 및 정량을 위해 TLC, GC/MS 조건을 확립하였고 이를 이용해 초대추출물 및 용매분배추출물, 최종 분리 활성물질에서 linoleic acid 함량을 확인한 결과 각각 1.3, 7.9, 24 mg/ml 농도로 존재함을 확인하였음
- Bio-X4의 유래 약리활성물질의 물리？화학적 성상 구명
■ Bio-X4 유래 유효물질(Rf값 0.41)을 얻기 위해 에탄올-메틸렌클로라이드 분배추출물또한, 위와 동일하게 분획화하고, 다시 HPTLC silica gel plates ($_{60F}254$ Merck), n-헥산/에칠아세테이트/메탄올(3/3/1) 용액으로 전개, 5% 황산-메탄올로 유도체화하여 366nm에서 확인하였음
- 유효물질 분획은 2-4/dinitrophenylhydrazine(DNP), ferric acid, dragendorff reagent, permanganate, p-anisaldehyde, ninhydrin 등을 이용하여 정색반응 한 결과 2,4-dinitrophenylhydrazine(2,4-DNP)에서 오렌지색의 발색이 확인되어 알데히드, 케톤, 글리코사이드류 중의 하나로 추정되었고 HPTLC scanner를 이용하여 순도를 확인한 결과 0.2 mg/ml 농도에서 90% 정도의 순물질로 확인되었음
■ 이 유효물질은 Atlantis T3 칼럼(4.6*150mm, 5μm), 아세토니트릴/증류수(45/55) 이동상 및 질량분석기 cone voltage 30V, collision energy 30V 조건 하에서 m/z 389(parent), 209(daughter) 이온화 되었고, 0.05-0.2mg/ml 농도구간에서 직선성이 인정되었음($^{r}2$>0.94)
■ 세부과제명: 식물추출물의 효능 및 안전성 평가
○ In vitro test를 통한 식물추출물의 효능확인
가. 5종의 자생식물 초대추출물을 대상으로 Disc diffusion test를 이용하여 주요 설사원인균으로 알려진 E. coli, Salmonella typhimurium 등에 대한 항균효과를 분석한 결과
- Bio-X1 및 Bio-X2 수액추출물, Bio-X2 및 Bio-X3 메탄올, 에탄올추출물 등에서 E. Coli에 대해, Bio-X2 메탄올 및 수액추출물, Bio-X3 메탄올 및 에탄올추출물, Bio-Xm 메탄올추출물에서 Salmonella typhimurium에 대한 항균효과를 확인하였음
나. 주요 설사원인균에 대해 초대추출물을 5종의 용매로(Hx, Et, Mc, Ea, Bu) 용매분배 추출한 각 분획별 항균능을 조사한 결과
- Bio-X1 Mc, Ea, Et분획, Bio-X4 Bu분획, Bio-Xm Et분획 등에서 Salmonella typhimurium에 대해, Bio-X1 및 Bio-Xm Et분획 등에서 E. Coli에대해 항균효과 확인하였음
다. 가축에서 설사를 유발하는 주요 바이러스인 PED, Porcine rotavirus, BVD 및 Bovine rotavirus를 공시하여 자생식물 초대추출시료에 대한 항바이러스능을 검색한결과
- Bio-X3를 제외한 대부분의 자생식물 초대추출물이 PED, BVD 바이러스에 대해 4× ~ 64× 정도의 항바이러스능을 나타내었음
라. 주요 설사원인 바이러스에 대해 초대추출물을 5종의 용매로(Hx, Et, MC, EA, Bu) 용매분배추출한 각 분획별 항바이러스능을 확인한 결과
- Bio-X1 Hx분획, Bio-X2 Bu분획, Bio-X4 Ea분획, Bio-Xm Et분획 등에서 PED 바이러스에 대해, Bio-X1 Hx분획 및 Bio-X4 Ea분획 등은 BVD 바이러스에 대해서도 높은 항바이러스능을 나타내었음
○ 실험동물에 대한 식물추출물의 효능 및 안전성 조사
가. 항바이러스능이 확인된 분획에 대한 급성경구독성시험
- 항바이러스능이 강하므로 항바이러스 효과를 가장 강하게 나타내는 두가지 시료 (Bio-X1 Hx분획, Bio-X4 Ea분획)를 선정하여 마우스를 이용한 급성경구독성시험시행
- LD50 5g/kg 이상이었음
○ 자생식물 유래 약리활성물질의 항균 효과 평가
- Bio-X1 유래 유효분획(Rf값 0.31)은 S. aureus 및 6종의 가축유래 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)에 대해 최소억제농도 0.063-0.125 mg/ml, 최소살균농도 0.25-0.5 mg/ml로 나타났음
- 이 유효 분획은 아목시실린과 복합 효과는 무작용(indifference)이었고 옥사실린과는 상가효과(additive effect), 시프로플록사신과는 부분상승효과(partial synergy)를 보였음
- 유효분획에서 최종 분리한 단일물질인 linoleic acid는 S. aureus 및 6종의 가축유래 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)에 대해 최소억제농도 0.031-0.016 mg/ml, 최소살균농도 0.063 mg/ml로 나타났음
- Linoleic acid는 S. aureus에서 옥사실린과 복합 효과는 무작용(indifference)이었고 아목시실린 및 시프로플록사신과는 상가효과(additive effect)를 보였고, MRSA에서는 아목시실린과 옥사실린에서 부분상승효과(partial synergy), 시프로플록사신과는 상가효과를 나타내었음
○ 자생식물 유래 약리활성물질의 항바이러스 효과 평가
- Bio-X4 유래 유효분획(Rf값 0.41)은 PEDV, NDV 및 SIV(100TCID50/ml)를 0.002, 0.1, 0.008 mg/ml의 농도에서, Rf값이 0.19인 유효분획은 0.009, 0.1, 0.016 mg/ml에서 중화하였고, 유효분획(Rf값 0.41)은 IC50가 0.124-0.139 mg/ml로 선택계수(SI, selectivity index)가 59.2(PEDV) 및 15.8(SIV), Rf값이 0.19인 유효분획은 0.369-1.111 mg/ml로 SI가 39.4 및 70.8이었음
○ 가축 설사성 질환에 대한 약리활성 물질의 효능 조사
- 4일령 포유자돈을 이용하여 X4-MC 추출물을 3일간 3회/1일 경구투여하고 물질투여 첫째날 PEDV 장유제액을 경구접종 시행
- 10일간 임상증상관찰 및 분변채취를 시행한 결과

목차 Contents

• 제출서 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 4
• 1. 연구배경 ... 4
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 5
• 1. 공시재료 ... 5
• 2. 연구전략 및 방법 ... 5
• III. 연구결과 ... 6
• 1. 식물체중 약리활성 물질 분리 ... 6
• 2. 시험관내 시험을 통한 식물추출물의 약리활성 조사 ... 14
• 3. 식물추출물의 안전성 조사 ... 19
• IV. 고찰 ... 20
• V. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 21
• VI. 참고문헌 ... 22