초록 ▼

신규 항암 표적 분자로 주목 받고 있는 MCM 발현조절물질인 cedrol(CR)과 widdrol(WR)의 in vitro 항암 기작 규명과 in vivo 항암활성을 평가하여 이 물질을 항암제 또는 항암보조제로서의 개발 기반을 확립함
$\bullet$ MCM 단백질의 발현 저하 기작 규명
$\bullet$ CR과 WR의 인간 대장암 세포주 HT29에 대한 apoptosis induction 기작 규명
$\bullet$ CR과 WR의 HT29에 대한cell cy

신규 항암 표적 분자로 주목 받고 있는 MCM 발현조절물질인 cedrol(CR)과 widdrol(WR)의 in vitro 항암 기작 규명과 in vivo 항암활성을 평가하여 이 물질을 항암제 또는 항암보조제로서의 개발 기반을 확립함
$\bullet$ MCM 단백질의 발현 저하 기작 규명
$\bullet$ CR과 WR의 인간 대장암 세포주 HT29에 대한 apoptosis induction 기작 규명
$\bullet$ CR과 WR의 HT29에 대한cell cycle G1 arrest induction 기작 규명
$\bullet$ CR의 C57BL/6(melanoma), nude mouse(HT29) 양 모델에서 항암기작 규명
- Administration route ( I.P, oral, I.V, inhalation) 별 활성 비교 검토
- Dosage 별 항암활성
- Pharmacokinetics
$\bullet$ 난용성 CR의 약물이용효율 개선을 위한 약물전달체로서 PLGA를 이용한 micelle형nanomedicine의 제작과 in vitro, in vivo 활성 평가
$\bullet$ WR의 비만세포 3T3L1에 대한 differentiation inhibition 기작과 분화된 비만세포에서의 lipolysis 기작 규명

Abstract ▼

◎ Anticancer activity of cedrol and widdrol from Juniperus chinensis
$\bigcirc$ Apoptosis induction molecular mechanism of cedrol and widdrol in human colon adenocarcinoma HT29 cells
$\bigcirc$ Cell cycle G1 arrest molecular mechanism of cedrol and widdrol in human colon

◎ Anticancer activity of cedrol and widdrol from Juniperus chinensis
$\bigcirc$ Apoptosis induction molecular mechanism of cedrol and widdrol in human colon adenocarcinoma HT29 cells
$\bigcirc$ Cell cycle G1 arrest molecular mechanism of cedrol and widdrol in human colon adenocarcinoma HT29 cells
$\bigcirc$ Apoptosis induction molecular mechanism of cedrol in human cervix carcinoma HeLa cells
$\bigcirc$ In vivo anticancer activity of cedrol
- Anti-cancer efficacy evaluation of cedrol in C57BL/6 mouse injected B16/F10 Melanoma cell according to administration route( I.P, oral, I.V and inhalation) and dosage
- Anti-cancer efficacy evaluation of cedrol in xenograft model (nude mouse with Human colon tumor HT-29) according to administration route( I.P, oral, I.V and inhalation) and dosage
- Pharmaco-kinetics of cedrol in experimental animal
$\bigcirc$ Cedrol containing PLGA polymer nanoparticles for development of anticancer agent and its anticancer efficacy evaluation in vitro and in vivo
$\bigcirc$ Investigation of adipocyte differentiation molecural mechanism of antiobesity regulatory compound widdrol 15

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 초록 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 11
• CONTENTS ... 19
• 목차 ... 30
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 40
• 1. 연구개발의 목적 ... 40
• 2. 연구개발의 필요성 및 중요성 ... 40
• 가. 연구개발의 과학기술 및 사회경제적 중요성 ... 40
• 나. 연구개발의 기술적 필요성 ... 41
• (1) MCM 발현제어에 의한 항암제 개발의 필요성 ... 41
• (2) MCM 발현 제어물질인 cedrol과 widdrol의 제품화의 따른 연구 개발 필요성 ... 42
• (3) 항비만제 개발의 필요성 ... 43
• (4) PPARγ 발현제어에 의한 지방세포 분화 억제제 개발의 필요성 ... 44
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 47
• 1. 세포주기 조절을 통한 항암제 개발 현황 ... 47
• 2. MCM 복제 단백질 관련 분야에 대한 기술 개발 현황 ... 48
• 3. Nanoparticle 개발에 대한 기술개발 현황 ... 49
• 4. 항비만 관련 기술개발 현황 ... 50
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 53
• 제1절 향나무로부터 분리한 cedrol의 항암활성 ... 53
• 1. 인간 대장암 세포주인 HT29 세포에 대한 cedrol의 항암활성 ... 53
• 가. 서 론 ... 53
• 나. 재료 및 방법 ... 59
• (1) 재료 ... 59
• (2) 세포독성 효과 측정 ... 60
• (3) 세포 증식 억제 효과 측정 ... 60
• (4) DAPI 염색법 ... 60
• (5) DNA 단편화 ... 61
• (6) 세포주기 변화 측정(Flow cytometry) ... 61
• (7) DNA chip 분석 ... 62
• (8) Real time PCR ... 63
• (9) 암세포의 항암 관련 단백질 발현 검토 ... 64
• (10) 면역 침전(Immunoprecipitation)에 의한 pRb : E2F1 복합체 형성 확인 ... 65
• 다. 결과 및 고찰 ... 65
• (1) 암세포에 대한 cedrol의 세포독성 측정 ... 65
• (2) HT29 세포에 대한 cedrol의 세포 증식 억제 효과 측정 ... 67
• (3) Cedrol을 처리한 HT29 세포의 자가소멸 소체 생성 확인 ... 68
• (4) Cedrol에 의한 HT29 세포의 DNA fragmentation 확인 ... 68
• (5) Cedrol를 처리한 HT29 세포의 세포주기 변화 ... 69
• (6) Cedrol를 처리한 HT29 세포의 apoptosis pathway의 활성화 ... 70
• (7) Cedrol를 처리한 HT29 세포 유전자 발현 변화의 DNA Chip 분석 ... 72
• (8) Cedrol를 처리한 HT29 세포의 발현 변화 유전자의 real time PCR 분석 ... 73
• (9) Cedrol를 처리한 HT29 세포의 세포 주기 관련 단백질의 발현 변화 확인 ... 74
• (10) Cedrol를 처리한 HT29 세포의 p21와 CDK2의 결합능 분석 ... 75
• (11) Cedrol를 처리한 HT29 세포의 pRB와 E2F1의 결합능 분석 ... 76
• (12) Cedrol를 처리한 HT29 세포의 MCM 단백질의 발현 저하 확인 ... 77
• 2. 인간 자궁암 세포주인 HeLa 세포에 대한 cedrol의 항암활성 ... 78
• 가. 재료 및 방법 ... 78
• (1) HeLa 세포배양 ... 79
• (2) 재료의 구입 및 분리 ... 79
• (3) 세포 독성 측정 ... 79
• (4) 세포 성장 억제 효과 ... 79
• (5) DAPI 염색법 ... 80
• (6) Annexin V-FITC 염색법 ... 80
• (7) DNA fragmentation ... 80
• (8) Western blot analysis ... 81
• 나. 결과 및 고찰 ... 82
• (1) Cedrol의 세포사 유도 효과 ... 82
• (2) Cedrol의 HeLa 세포 성장 억제 효과 ... 83
• (3) DAPI 염색 ... 84
• (4) Annexin V-FITC 염색 ... 85
• (5) DNA fragmentation ... 86
• (6) Western blot analysis ... 87
• (가) Cedrol의 MCM 단백질 발현 저하 활성 ... 87
• (나) Apoptosis 유도 단백질의 발현량 변화 ... 88
• 3. 동물 모델에서의 cedrol의 항암활성 ... 90
• 가. 재료 및 방법 ... 90
• (1) 동물 모델에서의 cedrol에 의한 고형암 변화 ... 90
• (가) 암 발생 억제 효과 ... 90
• (나) 암 조직 감소 효과 ... 90
• (다) 암 재발 억제 효과 ... 91
• (2) B16/F10 melanoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 cedrol의 복강투여에 의한 항암약효 평가 ... 91
• (3) Human colon tumor (HT-29) xenograft model에서 cedrol의 복강투여에 의한 항암약효평가 ... 91
• (4) Human colon tumor (SW620) xenograft model에서 cedrol의 경구투여 의한 항암약효평가 ... 92
• (5) Human colon tumor (HT-29) xenograft regression model에서 cedrol의 I.V bolus와 Infusion 투여 의한 항암약효평가 ... 92
• (6) Cedrol의 pharmacokinetics ... 92
• (7) Cedrol의 최적 투여 방법 검토 ... 93
• (가) Sarcoma-180 carcinoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 cedrol 훈증에 의한 항암약효 평가 ... 93
• (나) B16/F10 melanoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 cedrol 훈증에 의한 항암약효 평가 ... 93
• (다) B16/F10 melanoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 타 AROMA OIL 훈증에 의한 항암약효 비교 평가 ... 93
• (라) Human colon tumor (HT-29) xenograft regression model에서 cedrol의 훈증에 의한 항암약효평가 ... 93
• (마) Cedrol의 혈중 농도 측정 ... 94
• (바) B16/F10 melanoma cell을 SQ 주사한 C57BL/6 mouse에서 적복령 추출물 병행요법에 의한 cedrol 항암약효 평가 ... 94
• (사) B16/F10 melanoma cell을 SQ 주사한 C57BL/6 mouse에서 신생혈관억제제 avastin 병행요법에 의한 cedrol 항암약효 평가 ... 94
• 나. 결과 및 고찰 ... 95
• (1) 동물 모델에서의 cedrol에 의한 고형암 변화 ... 95
• (가) 암 발생 억제 효과 ... 95
• (나) 암 조직 감소 효과 ... 95
• (다) 암 재발 억제 효과 ... 95
• (2) B16/F10 melanoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 cedrol의 복강투여에 의한 항암약효 평가 ... 97
• (3) Human colon tumor (HT-29) xenograft model에서 cedrol의 복강투여 의한 항암약효평가 ... 98
• (4) Human colon tumor (SW620) xenograft model에서 cedrol의 경구투여 의한 항암약효평가 ... 100
• (5) Human colon tumor (HT-29) xenograft regression model에서 cedrol의 I.V bolus와 infusion 투여 의한 항암약효평가 ... 101
• (6) CR의 생체내 pharmacokinetics ... 103
• (7) Sarcoma-180 carcinoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 cedrol 훈증에 의한 암약효 평가 ... 103
• (8) B16/F10 melanoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 cedrol 훈증에 의한 항암약효 평가 ... 104
• (9) B16/F10 melanoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 타 AROMA OIL 훈증에 의한 항암약효 비교 평가 ... 106
• (10) Human colon tumor (HT-29) xenograft regression model에서 cedrol의 훈증에 의한 항암약효평가 ... 107
• (11) Cedrol의 혈중 농도 측정 ... 108
• (12) B16/F10 melanoma cell을 SQ 주사한 C57BL/6 mouse에서 avastin 병행요법에 의한 cedrol 항암약효 평가 ... 109
• (13) B16/F10 melanoma cell을 SQ 주사한 C57BL/6 mouse에서 적복령 추출물의 병행요법에 의한 cedrol 항암약효 평가 ... 110
• 제2절 향나무로부터 분리한 widdrol의 항암 활성 ... 111
• 1. 서론 ... 111
• 2. 인간 대장암 세포주 HT29 세포에 대한 widdrol의 항암 활성 ... 118
• 가. 재료 및 방법 ... 118
• (1) 재료 ... 118
• (가) 시료 ... 118
• (나) 세포 배양 ... 119
• (2) 세포독성 효과 측정 ... 119
• (3) 세포 증식 억제 효과 측정 ... 119
• (4) DAPI 염색 ... 120
• (5) apoptosis 관련 유전자의 발현 검토 ... 120
• (6) 세포 주기 변화 측정 (Flow cytometry) ... 121
• (7) DNA chip 분석 ... 121
• (8) Real time PCR ... 123
• (9) Widdrol처리에 의한 세포 주기 관련 단백질 발현 양상 검토(Western blotting) ... 124
• (10) 면역 침전(Immunoprecipitation) ... 124
• (11) B16/F10 melanoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 widdrol 시료의 복강투여에 의한 항암약효 평가 ... 124
• 나. 결과 및 고찰 ... 125
• (1) HT29세포에 대한 widdrol의 세포독성 측정 ... 125
• (2) HT29세포에 대한 widdrol의 세포 증식 억제 효과 ... 126
• (3) Widdrol을 처리한 HT29 세포의 자가소멸 소체 생성 확인 ... 126
• (4) Widdrol을 처리한 HT29세포의 세포주기 변화(Flow cytometry) ... 127
• (5) Widdrol을 처리한 HT29 세포의 apoptosis pathway의 활성화 ... 128
• (6) Widdrol 처리에 의한 유전자 발현 변화 분석(DNA chip) ... 129
• (7) Widdrol처리에 의한 세포 주기 관련 단백질의 발현 변화 검토 ... 131
• (8) Widdrol처리에 의한 MCM 단백질의 발현 저하 검토 ... 131
• (9) Widdrol을 처리에 의한 발현 변화 유전자의 real time PCR 분석 ... 132
• (10) B16/F10 Melanoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 widdrol 시료의 복강투여에 의한 항암약효 평가 ... 133
• 3. 인간 폐암 세포주에 대한 widdrol의 항암 활성 ... 134
• 가. 재료 및 방법 ... 134
• (1) 세포배양 ... 135
• (2) 재료의 구입 및 분리 ... 135
• (3) 세포사 유도 ... 135
• (4) 세포성장 억제 ... 135
• (5) DAPI 염색 ... 136
• (6) Annexin V-FITC 염색 ... 136
• (7) DNA fragmentaion ... 136
• (8) 세포주기 분석 ... 137
• (9) Microarray 분석 ... 137
• (10) Western blot analysis ... 138
• (11) Immunoprecipitation analysis ... 139
• 나. 결과 및 고찰 ... 139
• (1) Widdrool의 분리 ... 139
• (2) Widdrol의 세포사 유도 효과 ... 143
• (3) A549 세포에 대한 widdrol의 세포 성장 억제 효과 ... 144
• (4) DAPI staining에 의한 세포고사체(apoptotic body) 확인 ... 145
• (5) Annexin V-FITC 염색에 의한 세포막 변화 확인 ... 145
• (6) DNA fragmentation 확인 ... 146
• (7) Widdrol에 의한 세포주기 변화 ... 147
• (8) Widdrol에 의한 A549 세포의 MCM 단백질의 발현 변화 확인 ... 148
• (9) Microarray analysis ... 149
• (10) Western blot analysis ... 152
• (가) Cell cycle 연관 단백질의 발현량 변화 ... 152
• (나) Apoptosis 연관 단백질의 발현량 변화 ... 153
• (11) Immunoprecipitation analysis ... 154
• (가) Widdrol에 의한 CDK2와 cyclin E 결합능 변화 분석 ... 154
• (나) Widdrol에 의한 E2F1과 Rb 결합능 변화 분석 ... 155
• (다) Widdrol에 의한 PCNA와 p21 결합능 변화 분석 ... 156
• (라) Widdrol에 의한 Bax와 Bcl-xL 결합능 변화 분석 ... 157
• 제3절. PLGA 나노파티클로부터 방출되는 cedrol의 항암활성 ... 158
• 1. 서 론 ... 158
• 2. 재료 및 방법 ... 167
• 가. 재료 ... 167
• (1) 시료 ... 167
• (2) 암세포주와 배양 ... 167
• 나. Nanomedicine(NM)의 제작 방법 ... 168
• 다. Nanomedicine(NM)의 물성평가 ... 169
• (1) Particle 크기 분석 ... 169
• (2) 표면구조 분석 ... 169
• (3) DSC 분석 ... 169
• (4) XPS 분석 ... 169
• 라. NM의 활성평가 ... 170
• (1) 약물 포집 효율 측정 ... 170
• (2) 약물의 서방성 방출실험 ... 170
• 마. NM의 세포독성 ... 170
• 바. 암세포의 항암 관련 단백질 발현 검토 ... 171
• 사. Sarcoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 NM의 동물실험 효능 평가 ... 172
• (1) 암 발생 억제 효과 ... 172
• (2) 암 조직 감소 효과 ... 172
• (3) 암 재발 억제 효과 ... 172
• 아. B16/F10 melanoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 NM의 동물실험 효능 평가 ... 172
• (1) 복강투여에 의한 항암약효 평가 ... 173
• (2) 경구투여에 의한 항암약효 평가 ... 173
• (3) I.V투여에 의한 항암약효 평가 ... 173
• 3. 결과 ... 173
• 가. Particle size 분포 ... 173
• 나. 표면구조 분석 ... 175
• 다. DSC 분석 ... 179
• 라. XPS 분석 ... 181
• 마. 약물 포집 효과 ... 184
• 바. 약물의 서방성 방출실험 ... 186
• 사. NM의 세포독성 효과 ... 187
• 아. NM을 처리한 HT29 세포의 MCM 단백질의 발현 저하 확인 ... 190
• 자. Sarcoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 NM의 동물실험 효능 평가 ... 191
• (1) 암 발생 억제 효과 ... 191
• (2) 암 조직 감소 효과 ... 191
• (3) 암 재발 억제 효과 ... 192
• 차. B16/F10 melanoma cell을 주사한 C57BL/6 mouse에서 NM의 동물실험 효능 평가 ... 193
• (1) 복강투여에 의한 항암약효 평가 ... 193
• (2) 경구투여에 의한 항암약효 평가 ... 194
• (3) I.V투여에 의한 항암약효 평가 ... 194
• 4. 고찰 ... 196
• 제4절. Widdrol의 항비만 작용기작 규명 ... 198
• 1. 서 론 ... 198
• 2. 재료 및 방법 ... 213
• 가. 세포배양 ... 213
• 나. 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로의 분화 ... 213
• 다. 재료의 구입 및 분리 ... 213
• 라. Oil Red O 염색법 ... 214
• (1) Lipolysis ... 214
• (2) Differentiation inhibition ... 214
• 마. Glycerol 방출량 측정 ... 215
• 바. Microarray 분석 ... 215
• 사. 단백질 발현량 확인 ... 216
• 3.. 결과 ... 217
• 가. Juniperus chinensis 활성물질 분리 ... 217
• 나. Oil Red O staining을 통한 Juniperus chinensis 추출물 활성효과 확인 ... 218
• 다. Widdrol 분리 ... 219
• 라. Widdrol의 triglyceride 분해 효과 ... 220
• 마. Widdrol의 lipolysis 효과 ... 222
• 바. Widdrol의 differentiation inhibition 효과 ... 223
• 사. Microarray 분석 ... 224
• (1) Lipolysis ... 224
• (2) Differentiation inhibition ... 225
• 아. 단백질 발현량 확인 ... 226
• 4. 고찰 ... 227
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 232
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 234
• 1. Cedrol and/or widdrol의 p21과 MCM의 연관된 novel anticancer machanism 규명 ... 234
• 2. Cedrol의 사업화 또는 실제 임상 투여를 위한 최적 조건 검토 ... 234
• 3. Widdrol의 항비만 in vivo 효능 평가 ... 234
• 4. 기업화 추진 방향 ... 235
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 236
• 1. 세포주기 조절을 표적으로 한 항암제 ... 236
• 2. 난용해성 물질의 효능효과를 향상시키고자 한 nanoparticle ... 237
• 3. Lipolysis, differentiation inhibition을 표적으로 한 비만치료제 ... 238
• 제7장 참고문헌 ... 241