초록 ▼

1. 정액의 바이러스성 질병 진단용 PCR 기법 표준화
6개소 인공수정센터 웅돈 원정액 총 349 샘플에서 Shin 등13)의 방법을 사용하여 정자두부를 제거 한 후 상층액을 사용하여 Hennings 등5)의 RLT lysis buffer (proprietary, kit provided)/centrifugation/RNeasy protocol 방법을 변형하여 바이러스 DNA/RNA를 추출 하고 CSFV/BVDV Multiplex RT-PCR reagent, PCV2 PCR reagent, PMWS Multiplex RT-PCR

1. 정액의 바이러스성 질병 진단용 PCR 기법 표준화
6개소 인공수정센터 웅돈 원정액 총 349 샘플에서 Shin 등13)의 방법을 사용하여 정자두부를 제거 한 후 상층액을 사용하여 Hennings 등5)의 RLT lysis buffer (proprietary, kit provided)/centrifugation/RNeasy protocol 방법을 변형하여 바이러스 DNA/RNA를 추출 하고 CSFV/BVDV Multiplex RT-PCR reagent, PCV2 PCR reagent, PMWS Multiplex RT-PCR reagent(PRRSV EU/US, PCV2), Abortion Multiplex PCR reagent (ADV/PPV), Abortion multiplex RT-PCR reagent(PRRSV/JEV/EMCV)(Jenobiotech, KOR)를 사용하여 PCR/RT-PCR하여 정액에서 효과적으로 바이러스를 검출하는 진단기법을 확립하였다.
2. 인공수정 센터 웅돈의 바이러스성 질병 항체, 항원 검사
가. 바이러스성 질병 항체검사
3개소 인공수정 센터의 웅돈 총 111두의 혈액을 채취하여 3,000rpm에 15분 동안 원심분리 한 후 상층액을 56℃에서 30분 동안 비동화시켜 CSFV-Ab ELISA, PCV-2 NCAb ELISA, PRRSV-NCAb ELISA, ADV-gEAb ELISA(Jenobiotech, KOR)와 PPV ELISA(SVANOVA, Sweden)를 사용하여 검사한 인공수정센터 웅돈의 바이러스성 질병 항체검사를 한 결과 CSFV, PCV2, PRRSV는 전체 111샘플중 각각 105(94.6%), 92(82.9%), 100(90.1%) 샘플에서 양성 항체가가 측정되어 높은 항체 양성률을 기록한 반면 PPV는 7.2%의 낮은 항체 양성률을 기록하였고 ADV에서는 양성 항체가가 측정되지 않았다. 인공수정센터별 바이러스 항체 양성률은 A 인공수정센터에서 CSFV 98.5%, PCV2 79.1%, PRRSV 95.5%, PPV1.5%, B 인공수정센터에서 CSFV 95.8%, PCV2 79.2%, PRRSV 66.7%, PPV 2.8%, C 인공수정센터에서 CSFV 80.0%, PCV2 100.0%, PRRSV 100.0% PPV 30.0%를 보였고, 모든 인공수정센터에서 ADV 항체 양성률은 0% 였다.
나. 바이러스성 질병 항원검사
6개소 인공수정센터 웅돈 원정액 349샘플을 대상으로 정자 두부를 제거한 후 RNeasy Mini Kit protocol을 변형한 방법을 사용하여 바이러스 DNA/RNA를 추출하고 PCR/RT-PCR을 실시한 결과 PCV2, PRRSV는 전체 349샘플 중 각각 73(20.9%), 44(12.6%)의 샘플에서 항원이 검출되어 상대적으로 높은 항원 검출률을 기록한 반면 JEV, EMCV, PPV는 각각 4(1.1%), 3(0.9%), 1(0.3%)의 샘플에서 항원이 검출되어 낮은 항원 검출률을 보였다. CSFV, BVDV의 경우 1차 RT-PCR검사에서 양성, 의양성 반응을 보인 샘플을 대상으로 DNA chip검사를 한 결과 모두 음성으로 판명되었으며, ADV의 경우 1차 PCR검사에서 양성, 의양성 반응을 보인 샘플을 대상으로 다시 한번 2차 PCR 검사를 한 결과 모두 음성으로 판명되어 CSFV, BVDV, ADV 모두에서 항원은 검출되지 않았다. 인공수정센터별 바이러스 항원 검출률은 A 인공수정센터에서 PRRSV 23.1%, PCV2 20.5%, JEV 1%, EMCV 1%, B 인공수정센터에서 PCV2 29.2%, PRRSV 20.8%, JEV 4.2%, EMCV 4.2%, C 인공수정센터에서 PCV2 25.0%, PRRSV 5.0% EMCV 5.0%, D 인공수정센터에서 PCV2 27.3%, JEV 4.5%, E 인공수정센터에서 PCV2 22.2%, PRRSV 11.1%, F 인공수정센터에서 PCV2 15.7%, PRRSV 6.5% PPV 0.9%를 보였고, 모든 인공수정센터에서 CSFV, BVDV, ADV 항원은 검출되지 않았다.
3. 인공수정 센터 웅돈의 세균성 및 기생충성 질병 검출
가. 세균성 및 기생충성 질병 항체검사
3개소 인공수정 센터의 웅돈 111두의 혈액을 채취하여 3,000rpm에 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 56℃에서 30분동안 비동화시킨 후 POURQUIER® ELISA Toxoplasma gondii serum screening(POURQUIER, FRA), POURQUIER® ELISA Trichinella spiralis serum screening(POURQUIER, FRA)를 사용하여 실험 한 결과 Toxoplasma gondii는 2샘플에서 양성 항체가가 측정되어 2%의 항체 양성률을 보였고, Trichinella spiralis는 양성 항체가가 측정되는 샘플이 관찰되지 않았다. 인공수정센터별 Toxoplasma gondii 항체 양성률은 A 인공수정센터에서 1.5%, B 인공수정센터에서 4.2%, C 인공수정센터에서 0.0%를 보였다. 시험관 응집반응을 사용하여 브루세라 항체를 검사한 결과 모든 혈청에서 양성반응은 관찰되지 않았다.
나. 브루세라 항원검사
6개소 인공수정센터 웅돈 원정액 349샘플을 대상으로 정자 두부를 제거하여 브루세라 DNA를 RNeasy Mini Kit protocol을 변형한 방법을 사용하여 추출하였고 Bricker 등1)의 방법을 사용하여 B. abortus, B. melitensis, B. ovis, B. suis (AMOS) PCR을 한 결과, 모든 샘플에서 브루세라 항원은 검출되지 않았다.

Abstract ▼

Reproductive diseases causing abortion and stillbirth in pigs evoke great economic losses of the pig industry in productivities and profits. There are many causative agents of abortion and stillbirth in pigs such as viral, bacterial and parasitic pathogens, stress and environmental factors of farms.

Reproductive diseases causing abortion and stillbirth in pigs evoke great economic losses of the pig industry in productivities and profits. There are many causative agents of abortion and stillbirth in pigs such as viral, bacterial and parasitic pathogens, stress and environmental factors of farms. These pathogens are transmitted via physical contacts, aerosol, milk and contaminated semen. The epidemioloy of animal diseases causing abortion and stillbirth have changed significantly by the introduction of artificial insemination. The application of artificial insemination prevents the transmission and spread of reproductive diseases by direct contact between males and females, and it has been proven that artificial insemination improves the control of many diseases. On the other hand, abortion and stillbirth caused by contaminated semen of artificial insemination can be enormous, since contaminated semen can infect numerous farms, areas, or even countries within a few hours or days. Since semen is widely disseminated for artificial insemination and the reproductive diseases can cause significant health and economic consequences, it is essential to have well-validated and rapid diagnostic techniques to detect pathogens for diagnostic and research purpose. Virus isolation is most accurate method to detect virus, but virus isolation from semen on continuous cell lines is difficult. Frequently, cyto-toxic factors in semen inhibit growth of the cells cultured for virus isolation. As a consequence, this method is time-consuming, laborious, and expensive. To circumvent this problem, PCR has the potential to provide a sensitive, rapid, and specific method to detect viruses in semen. But, because some factors of sperm head inhibit extraction of viral DNA/RNA in semen. The purpose of this study was to detect of antibodies and antigens causing abortion and stillbirth in serum and semen from the boars of Korean AI centers.
To detect of viral, bacterial, parasitic antibodies and antigens, 111 sera from 3 AI centers were measured for antibodies to CSFV, PCV2, PRRSV, ADV, PPV, Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis and Brucella spp. by ELISA and tube agglutination test and 349 semen samples from 6 AI centers were examined for antigens to CSFV, PCV2, PRRSV, ADV, PPV, JEV, EMCV and Brucella spp.(B. abortus, B. melitensis, B. ovis, B. suis) by PCR/RT-PCR. For ELISA and tube agglutination test, the sera were separated by centrifugation at 3,000 ？ g for 15 min at 4℃ and incubated at 56℃ for 30 min. All serum samples were stored at -20℃. For ELISA test, CSFV-Ab ELISA, PCV-2 NCAb ELISA, PRRSV-NCAb ELISA, ADV-gEAb ELISA(Jenobiotech, KOR) and PPV ELISA(SVANOVA, Sweden), POURQUIER® ELISA Toxoplasma gondii serum screening and POURQUIER® ELISA Trichinella spiralis serum screening(POURQUIER, FRA) were used. The tube agglutination test was processed routinely. For PCR/RT-PCR, whole semen(200㎕) was treated with equal volume of proteinase digestion buffer(200㎍/ml proteinase K, 20 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0, 2% SDS) at 37℃ for 10 min and centrifuged at 12,000 ？ g for 30 s to remove sperm heads and the supernatant was used. CSFV/BVDV Multiplex RT-PCR reagent, PCV2 PCR reagent, PMWS Multiplex RT-PCR reagent(PRRSV EU/US, PCV2), Abortion Multiplex PCR reagent (ADV/PPV) and Abortion Multiplex RT-PCR reagent(PRRSV/JEV/EMCV)(Jenobiotech, KOR) were used. DNA chip was examined using CSFV/BVDV Genotyping DNA chip(Jenobiotech, KOR) to distinguish CSFV from BVDV when CSFV/BVDV multiplex RT-PCR was positive.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...2
• 요약문 ...3
• SUMMARY ...6
• 목차 ...9
• I. 서 언 ...10
• II. 재료 및 방법 ...11
• 1. 정액의 바이러스성 질병 진단용 PCR 기법 표준화 ...11
• 2. 인공수정 센터 웅돈의 바이러스성 질병 항체, 항원 검사 ...14
• 3. 인공수정 센터 웅돈의 세균성 및 기생충성 질병 검출 ...18
• III. 결과 및 고찰 ...22
• 1. 정액의 바이러스성 질병 진단용 PCR 기법 표준화 ...22
• 2. 인공수정 센터 웅돈의 바이러스성 질병 항체, 항원 검사 ...25
• 3. 인공수정 센터 웅돈의 세균성 및 기생충성 질병 검출 ...32
• IV. 종합결과 ...33
• V. 적 요 ...34
• VI. 인용문헌 ...35