초록 ▼

2008년 선행 연구를 통해 최적화된 ‘배아줄기세포를 이용한 in vitro 발생신경독성시험법’에 적
합한 수학적 예측모델을 개발하고 시험법의 신뢰성 평가기준을 확립하였다.
생명공학지원과의 2008년 선행연구에서는 다기관 공동연구협의체의 공동연구수행을 통해, 2007
년 연구 결과로 제시된 ‘배아줄기세포의 신경세포분화시험법’을 최적화하여 시험법의 이전가능성을
확인함으로써 in vitro 발생신경독성시험법의 시험계를 확립하였다. 본 연구에서는 이 시험계에 적
합한 수학적 예측모델을 개발하기 위해 발생신경독성

2008년 선행 연구를 통해 최적화된 ‘배아줄기세포를 이용한 in vitro 발생신경독성시험법’에 적
합한 수학적 예측모델을 개발하고 시험법의 신뢰성 평가기준을 확립하였다.
생명공학지원과의 2008년 선행연구에서는 다기관 공동연구협의체의 공동연구수행을 통해, 2007
년 연구 결과로 제시된 ‘배아줄기세포의 신경세포분화시험법’을 최적화하여 시험법의 이전가능성을
확인함으로써 in vitro 발생신경독성시험법의 시험계를 확립하였다. 본 연구에서는 이 시험계에 적
합한 수학적 예측모델을 개발하기 위해 발생신경독성물질로서 methylmercury, sodium arsenate,
sodium arsenite, valproic acid 및 음성대조물질로서 isoniazid, ascorbic acid, saccharin을 선정하고
각 물질에 의한 신경세포 분화억제 정도(ID50) 및 세포독성 정도(IC50)을 확인하였다. 분석방법은
ID50의 경우 FACS를 이용한 물질 농도별 TUJ1 양성세포의 비율 분석 및 MAP2 mRNA의
Taqman PCR 분석 방법을 이용하였고, IC50의 경우 미분화 세포(D3) 및 분화세포(3T3, Neuro2a)에
대한 MTT assay를 이용하였다. 선행연구에서 얻어진 3가지 물질(Lead(Ⅱ) acetate, aroclor 1254,
penicillin G)에 대한 데이터를 포함하여 총 10가지 물질(발생신경독성물질 6종, 음성대조물질 4종)에
대한 4개의 측정변수치를 이용하여 판별함수(예측모델)를 개발하였다. $ID_{50}$, $IC_{50}D3$,, $IC_{50}3T3$를 이용
한 판별함수 및 $ID_{50}$, $IC_{50}D3$, $IC_{50}Neuro2a$를 이용한 판별함수를 각각 10개의 판별변수(측정변수 4종
+ 변수간 거리변수 6종) 중 전진선택법과 단계별증감법 또는 후진소거법에 의해 선택된 변수를 이
용하여 도출하였다. 그 결과 $IC_{50}Neuro2a$ 대신 $IC_{50}3T3$를 이용한 예측모델의 함수 형태가 비교적
단순하고 오분류율이 낮은 것으로 확인되었다.
확립된 시험법의 신뢰성 평가기준을 확립하기 위해 양성대조물질인 methylmercury에 대해 두
실험자가 각각 20회 반복실험을 수행하여 각 측정변수별 95% 신뢰구간을 설정하였다. 또한 두 실
험자의 4개의 측정변수치 간에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않음을 확인하여 시험법의 실험실
내 반복성을 확보하였다.
이번 연구를 통해 배아줄기세포를 이용한 in vitro 발생신경독성시험법의 시험계에 적합한 예측
모델을 개발함으로써 시험법 개발을 완료하였다. 향후 여러 가지 시험물질에 대한 추가 실험을 통
해 시험계 및 예측모델을 더욱 최적화한 다음 밸리데이션을 확보하여 국제적으로 인정받는 시험법
으로 발전할 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼

We developed an prediction model for the in vitro developmental neurotoxicity test which
was optimized by collaborative study group in 2008. And we also established confidence limits
for quality control of the test.
In a previous study, we optimized the method of neuronal differentiation of

We developed an prediction model for the in vitro developmental neurotoxicity test which
was optimized by collaborative study group in 2008. And we also established confidence limits
for quality control of the test.
In a previous study, we optimized the method of neuronal differentiation of embryonic stem
cells and presented the method as a test system for the in vitro developmental neurotoxicity
test. In this study, we selected additional developmental neurotoxicants such as methylmercury,
sodium arsenate, sodium arsenite and valproic acid and chemicals for negative control such as
isoniazid, ascorbic acid, and saccharin. and we identified the degree of inhibition of neuronal
differentiation(ID50) and cytotoxicity(IC50) for each chemicals. The ID50 values were obtained
by analyzing TUJ1 positive cells using flow cytometry and MAP2 mRNA using Taqman PCR.
The IC50 values were obtained by MTT assay using D3, 3T3 and Neuro2a cells. We developed
discriminant functions(prediction models) using the values of the four end points from total 10
chemicals including those from previous study(data of lead(Ⅱ) acetate, aroclor 1254 and
penicillin G). The discriminant functions using $ID_{50}$, $IC_{50}D3$, $IC_{50}3T3$ and $ID_{50}$, $IC_{50}D3$,$IC_{50}Neuro2a$
were derived from variables selected from 10 discriminant functions using forward and stepwise
selection or backward elimination. As a result, discriminant functions using IC503T3 instead of
IC50Neuro2a were simple and showed low error count estimates.
To establish confidence limits for quality control of the test, two experimenters conducted
the test for 20 times and identified 95% confidence intervals for each end points. And the end
points from two experimenters were not different from each other statistically.
We established a complete in vitro developmental neurotoxicity test with prediction models
suitable for the in vitro developmental neurotoxicity test system. Further optimization and
validation of the in vitro test using additional data of various chemicals are required for
improving the test method.

목차 Contents

• 최종보고서 ... 1
• 요약문 ... 5
• Summary ... 6
• 목차 ... 7
• I. 연구개발과제 연구결과 ... 8
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 8
• 제1절 연구개발과제의 목표 ... 8
• 제2절 연구개발과제의 필요성 ... 8
• 제2장 연구개발과제의 국내.외 연구개발 현황 ... 10
• 제1절 국내?외 연구실적 ... 10
• 제2절　당해연구기관의 실적 ... 10
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 11
• 제1절 연구수행내용 ... 11
• 제2절 연구결과 ... 13
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 26
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 29
• 제1절 목표달성도 ... 29
• 제2절 관련분야에의 기여도 ... 29
• 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획 ... 30
• 제7장 참고문헌 ... 31
• 제8장 첨부서류 ... 32