초록 ▼

특정 mRNA를 서열 특이적으로 분해하여 관련 단백질 합성을 차단하는 siRNA 기술이 빠른 속도로 개발되고 있어 이를 이용하여 암 등의 각종 질환 치료에 적용된 유전자치료제가 개발되고 있다. 그러나 이러한 실정에도 불구하고, siRNA를 이용한 면역세포의 활성화가 접목된 유전자치료제의 안전성과 유효성 평가기준 및 시험방법이 제시 되지 않은 실정이다. 따라서 본 1차년도 연구에서는 (1) 시험관내 siRNA의 생쥐 수지상세포내 도입 조건을 확립하였고, (2) siRNA로 형질 변형된 수지상세포의 유효성 평가를 위해 수지상세포의 표면

특정 mRNA를 서열 특이적으로 분해하여 관련 단백질 합성을 차단하는 siRNA 기술이 빠른 속도로 개발되고 있어 이를 이용하여 암 등의 각종 질환 치료에 적용된 유전자치료제가 개발되고 있다. 그러나 이러한 실정에도 불구하고, siRNA를 이용한 면역세포의 활성화가 접목된 유전자치료제의 안전성과 유효성 평가기준 및 시험방법이 제시 되지 않은 실정이다. 따라서 본 1차년도 연구에서는 (1) 시험관내 siRNA의 생쥐 수지상세포내 도입 조건을 확립하였고, (2) siRNA로 형질 변형된 수지상세포의 유효성 평가를 위해 수지상세포의 표면 분자의 활성정도, 시험관내에서 항원특이적인 T세포들로부터의 내성, 시험관내에서 수지상세포의 면역 유도능, 생체내 항암 면역 유도능 그리고 항암 면역 치료 효과를 확인 하였다. 그리고 (3) siRNA로 형질 변형된 수지상세포의 안전성 평가를 위해 siRNA 형질 주입된 수지상세포 면역 후 주사 부위의 지연성 과민 반응정도와 체중 변화를 확인 하였다. 결과로, (1) siRNA 형질 주입 효율을 90% 이상 되도록 조건을 확립하였으며, 또한 수지상세포의 유효성 확인 실험 결과, (2) IL-10 또는 IL-10 수용체를 siRNA로 표적화하였을 때 수지상세포의 활성화와 Th1 면역반응을 증가 시키는 결과를 보였다. BAK과 BAX를 siRNA로 표적화 하여 항원 특이적인 T세포의 공격에 대한 내성을 획득하였으며, 시험관내 면역 유도능의 증가와 생체내 수지상세포의 생존 기간의 증가를 확인 하였다. siRNA 형질 주입된 수지상세포의 임상적 실효성 확인을 위해 생체 내 항암 면역 유도능과 종양 치료 효능을 확인한 결과 PTEN, IL-10, IL-10 수용체, Bim 그리고 BAK/BAX와 같은 면역 유도능이 대조군에 비해 2배 이상 증가된 표적인자들을 선별 하였고, 선별된 siRNA를 형질 주입한 수지상세포들의 항암효능을 확인 한 결과 모두 유의성 있는 종양 치료 효능증강 효과를 확인 할 수 있었다. siRNA로 형질 주입된 수지상세포 백신의 안전성 평가를 위해 면역 후 면역 부위의 지연성 과민 반응과 체중변화를 확인한 결과 수지상세포에 siRNA를 형질주입하여 백신으로 이용 하는 것은 안전하나 수지상세포주를 이용하는 것은 부작용이 있을 것으로 사료 된다. siRNA로 형질전환된 인간 수지 상세포의 시험관 내 및 생체 내에서 면역 활성 조절 측정을 통한 유효성 및 안전성 평가 기술 수립을 위하여 본 2차년도 연구에서는 (1) 인간 유래의 수지상세포의 시험관 내 siRNA의 세포 도입 조건을 확립 하였고, (2) 시험관 내 인간 유래 수지상세포의 활성 증가 평가 방법 수립을 위해 HPV 16 E7 single chain trimer (SCT) 유전자의 인간 수지상세포 내 발현 조건을 확립 하였고, (3) siRNA를 처리한 인간 유래 면역 유전자치료제의 생체 내 유효성 평가기술 수립을 위해 생체 내에서 siRNA 처리된 수지상세포의 생존기간과 생체 내 면역 증강 효능을 확인하였음. 그 결과, (1) 90% 이상 CD1a+인 인간 단핵구 유래 수지상세포를 분화 방법과 시험관 내에서 인간 단핵구 유래 수지상세포에 siRNA를 형질 주입 하는 실험법을 확립 하고, (2) 수지상세포 내 E7-SCT 유전자의 발현조건을 확립하였고, (3) E7-SCT system을 이용하여 면역 결핍 마우스에 siRNA로 형질 변형된 수지상세포와 E7 항원 특이적인 T 세포들을 주입하여 생체 내에서 T세포들이 활성화 되는 정도를 확인 한 결과 대조군에 비하여 2배 이상 T세포의 활성이 증가 하는 결과를 확인하였음. 또한 (4) 항세포자멸인자인 BIM을 수지상세포 내에서 그 발현을 억제 하여 시험관 내에서 2배 이상 그리고 생체 내 주변 림프절에서 1.5배 이상의 생존률 증가를 확인하였음. 이상의 결과를 통해 siRNA를 이용한 수지상세포의 ex vivo 조작은 수지상 세포 백신의 효능을 증강 시키는 좋은 전략임을 확인하였으며, 상기의 방법들은 siRNA를 이용한 면역 유전자치료제의 유효성.안전성 평가에 활용될 수 있을 것으로 사료됨.

Abstract ▼

siRNA technique, which interfere the related protein synthesis by degrading specific mRNA, has been rapidly developed and used to develop gene therapeutic agents for treatment of various diseases. Nevertheless, availability and safety of an immune modulating siRNA based therapeutic agents has not be

siRNA technique, which interfere the related protein synthesis by degrading specific mRNA, has been rapidly developed and used to develop gene therapeutic agents for treatment of various diseases. Nevertheless, availability and safety of an immune modulating siRNA based therapeutic agents has not been known. It is necessary to optimize the efficacy and safety of the siRNA-based therapeutics. In this study, (1) we established of transfection methode that is transfection of siRNA into mouse dendritic cells. (2) To determine the efficacy of modified dendritic cells with siRNA in vitro and in vivo, we analysed the expression of surface molecule of dendritic cells, in vitro resistance of the DCs transfected with the siRNAs to $CD8^+$ T cell-mediated CTL-killing, in vitro activation of antigen-specific T cells by DCs transfected with siRNAs, generation of antigen specific CD8 T cell precursors and in vivo tumor treatment effects. And (3) To evaluate the safety of an immune modulating siRNA based therapeutic agents, delayed type hypersensitivity (DTH) response and change of body weight was measured after modified DC using siRNA vaccination. As a result, (1) we established of methode that transfection efficiency siRNA into mouse dendritic cells more than 90%. (2) Dendritic cells modified with IL-10 or IL-10R siRNA increased DC maturation and Th1 immunity. Bim, Bak or Bax targeting siRNAs could resist a CTL-induced apoptosis. IL-10, IL-10R, PTEN, Bim or Bak and Bax influenced the ability of the DCs to activate an E7-specific $CD8^+$ T cell line in vitro and in vivo, E7-specific $CD8^+$ T-cell precursors could translate into a better E7-specific antitumor effect, generates better antitumor effects than controls. (3) DC vaccine modified with siRNA was safe, in contrast to vaccination with a wellknown DC cell line, DC2.4 induced DTH response and significant decrease of body weight, suggesting that the vaccination with DC cell line could evoke harmful side effects. In this study, we have tried to establish evaluation methods of efficacy and safety of siRNA-transfected human dendritic cells (DCs) through in vitro and in vivo measurement of immune modulation capacity. For this, (1) we established transfection methode that deliver target siRNAs into human dendritic cells. (2) To determine the efficacy of siRNA-modified dendritic cells in vitro, we designed HPV 16 E7 single chain trimer (SCT) system and optimized its expression in human DCs. (3) To establish in vivo evaluation methods of efficacy in siRNA-treated human DCs, we measured in vivo longevity and immune priming capacity of the DCs. As a result, we established a method to differentiate human monocyte into $CD1a^+$ human DCs at more than 90% efficiency and a transfection method to delivery siRNA into human DCs. (2) We optimized the condition of E7-SCT expression in human DCs. (3) By using E7-SCT system, we confirmed the more than 2 fold increase in T cell activation by anti-apoptotic BIM siRNA-treated human DCs compared to control siRNA treated DCs. Moreover, these BIM siRNA-treated human DCs prolonged their life span both in vitro and in vivo by more than 2 fold and 1.5 fold, respectively. On the basis of these results, we confirmed that ex vivo manipulation of DCs with a genetic therapeutic siRNA could be a promising strategy to enhance their vaccine potency and these methods could be applicable to evaluate the efficacy and safety of siRNA-based immunogenetic therapeutic agents.

목차 Contents

• 용역연구개발과제 최종보고서 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• I. 연구개발결과 요약문 ...4
• 최종보고서 요약문 ...4
• Summary ...6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...8
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...19
• 1.3 국내.외 기술개발 현황 ...20
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...21
• 1. 시험관 내 siRNA의 세포 도입 조건 확립...21
• 2. 시험관 내 면역세포의 활성 확인 ...23
• 3. 시험관 내 siRNA 효능 측정를 위한 평가지표 수립 ...23
• 4. 생체 내 siRNA 처리된 세포 생존기간 확인 ...23
• 5. 생체 내 siRNA 처리된 세포의 분포변화 ...24
• 6. 생체 내 면역활성 siRNA의 면역 증강 효능 평가 ...24
• 7. siRNA 도입 수지상세포 백신의 안전성 평가 ...24
• 8. 인간 유래 면역세포의 시험관 내 siRNA의 세포 도입 조건 확립 ...25
• 9. 시험관 내 인간 유래 면역세포의 활성 증가 평가 방법 수립 ...25
• 10. siRNA를 처리한 인간 유래 면역유전자치료제의 생체 내 유효성 및 안전성 평가기술 수립 ...26
• 11. siRNA를 처리한 생쥐 유래 면역유전자치료제의 변형된 수지상세포의 특성 분석 ...27
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...28
• 1. 시험관 내 siRNA의 생쥐 수지상세포내 도입 조건 확립 및 수지상세포표현형의 변화 ...28
• 2. 시험관 내 생쥐 수지상세포의 활성 확인 ...29
• 3. 시험관 내 siRNA 효능 측정를 위한 평가지표 수립 ...29
• 4. 시험관 내 siRNA 효능 측정를 위한 평가지표 수립 ...30
• 5. 생체 내 siRNA 처리된 생쥐 수지상세포 생존기간 확인 ...30
• 6. 생체 내 면역활성 siRNA 처리된 생쥐 수지상세포의 면역 증강 효능 평가 ...31
• 7. 생체 내 면역활성 siRNA 처리된 생쥐 수지상세포의 항암 효능 평가 ...31
• 8. siRNA 도입 수지상세포 백신의 안전성 평가 ...32
• 9. 인간 유래 면역세포의 시험관 내 siRNA의 세포 도입 조건 확립 ...35
• 10. 시험관 내 인간 유래 면역세포의 활성 증가 평가 방법 수립 ...36
• 11. 인간 유래 수지상세포의 시험관 내 siRNA 세포 도입 조건 확립 ...38
• 12. siRNA를 처리한 인간 유래 면역유전자치료제의 시험관 내 유효성 및 안전성 평가기술 수립 ...38
• 13. siRNA를 처리한 생쥐 유래 면역유전자치료제의 변형된 수지상세포의 특성 분석 ...40
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...41
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...43
• 5.1 활용성과 ...43
• 5.2 활용계획 ...44
• 제6장 기타 주요변경사항 ...44
• 제7장 참고문헌 ...44
• 제8장 첨부서류 ...44