초록 ▼

본 과제에서는 플라스미드 DNA 유전자치료제의 약동력 시험법의 가이드(안) 마련을 위해 실제실험 예를 통해 시료의 준비, 밸리데이션, 생체시료에서 벡터표준품의 잔류량 측정법을 제시하는 것을 목표로 하였다.
첫째, 플라스미드 DNA 유전자치료제의 약동력 시험법을 위한 기본적인 Q-PCR용 시료의 준비과 정, Q-PCR 밸리데이션용 벡터표준품의 선정 및 보관방법, 벡터표준품에 특이적인 primer와 probe set의 제작방법, plasmid DNA의 크기(length)에 따른 real-time PCR 기기와 반응용 mixtur

본 과제에서는 플라스미드 DNA 유전자치료제의 약동력 시험법의 가이드(안) 마련을 위해 실제실험 예를 통해 시료의 준비, 밸리데이션, 생체시료에서 벡터표준품의 잔류량 측정법을 제시하는 것을 목표로 하였다.
첫째, 플라스미드 DNA 유전자치료제의 약동력 시험법을 위한 기본적인 Q-PCR용 시료의 준비과 정, Q-PCR 밸리데이션용 벡터표준품의 선정 및 보관방법, 벡터표준품에 특이적인 primer와 probe set의 제작방법, plasmid DNA의 크기(length)에 따른 real-time PCR 기기와 반응용 mixture 선정 방법 등을 실제 실험 예를 통해 제시하였다. 이 같이 실험 예를 통해 제시한 시료 준비과정의 표준실험방법과 가이드라인(안)을 다음의 항목으로 나누어 정리하였다. 1) Q-PCR 밸리데이션 시 genomic DNA 분리를 위한 동물에서의 장기와 혈액 채취 과정에서의 주의사항, 2) Q-PCR을 위한 벡터표준품의 최적 품질 조건 및 보관 방법에서의 주의사항, 3) Q-PCR 용primer 및 probe 제작 방법에 대한 주의사항, 4) 선정된 primer와 probe set에 적합한 Q-PCR용 Real time PCR 기기 및 Mixture 종류 선정 방법에 대한 주의사항
둘째, 미국 FDA guidance들을 근거로 한 Q-PCR 밸리데이션을 위한 기준 및 시험방법을 제시하고 이를 바탕으로 벡터표준품에 대한 밸리데이션을 실시하여 밸리데이션의 전과정 및 각 단계별주의 사항을 다음의 항목으로 나누어 정리하였다. 1) 정량구간 설정을 위한 기본 실험 지침 2) 3가지 QC 농도의 선정 후 정량분석법의 재현성 평가를 위한 일 내(intraday) 정확성(accuracy) 및정밀성(precision) 그리고 일간(interday) 정확성 및 정밀성 평가 방법에 관한 지침, 3) 밸리데이션시 세부유의사항 셋째, 밸리데이션이 완료된 Q-PCR 시험법을 이용하여 생체 내 투여 된 벡터표준품의 잔류량을 평가하는 방법을 실제 실험 예를 통해 제시하고 실험과정 중 주의사항을 다음의 항목으로 나누어 정리하였다. 1) 벡터표준품이 투여된 실험동물로부터 조직 분리 시 주의사항, 2) 조직 및 조직으로부터 분리정제한 genomic DNA의 보관 방법에 대한 주의사항, 3) Q-PCR의 재현성을 높이기 위한 조직처리방법 제시 감염성 질환, 허혈성 심혈관질환, 암 치료백신 등에 적용이 확대되고 있는 플라스미드 DNA 벡터의 비임상 약동력학 시험법 확립과 검증에 대해 개발자들이 많은 시행착오를 거치고 있다. 본 과제를 통해 도출된 플라스미드 DNA 유전자치료제의 약동력 시험법의 가이드(안)은 향후 전문가 자문과 관련 업계의 의견을 수렴하여 수정?보완할 예정이다. 개발자에게 제공한다면 국내 유전자 치료제개발 회사들의 임상시험을 위한 약동력학 연구에 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract ▼

The purpose of this study is to provide methods of sample preparation, real-time quantitative PCR(Q-PCR) validation, analysis of residual plasmid DNA standard in animal tissues in order to prepare the guideline of pharmacokinetic study for plasmid DNA gene therapeutics. Firstly, we provided sample

The purpose of this study is to provide methods of sample preparation, real-time quantitative PCR(Q-PCR) validation, analysis of residual plasmid DNA standard in animal tissues in order to prepare the guideline of pharmacokinetic study for plasmid DNA gene therapeutics. Firstly, we provided sample preparation procedure for Q-PCR, selection of plasmid DNA standard for Q-PCR validation and its optimum storage condition, design of plasmid DNA standard specific primer and probe set, selection of real time PCR machine and reaction mixture. We summarized the standard methods of sample preparation and the guideline as followed items. 1) precautions about gathering solid tissue and whole blood for genomic DNA isolation, 2) precautions about optimum quality of plasmid DNA standard for Q-PCR and its storage, 3) precautions about primer and probe set design for Q-PCR, 4) precautions about selection of suitable real time PCR machine and mixture type for the efficient Q-PCR reaction using the selected primer and probe set. Secondly, we provided standards and test methods for Q-PCR validation based on US FDA guidelines. We summarized precautions about the entire course and every step of Q-PCR validation as followed items. 1) basic guideline for setting up quantification range, 2) guideline of evaluation method of intra-day accuracy and precision as well as inter-day accuracy and precision for 3 QC concentrations in order to evaluate reproducibility of quantitative analysis, 3) detail precautions during Q-PCR validation. Lastly, we provided the analysis of residual plasmid DNA injected into animal tissue from some samples. We summarized precautions during experimental procedure as follows: 1) precautions about collecting tissues from animal injected with plasmid DNA, 2) precautions about the storage condition of genomic DNA isolated from whole blood and solid tissue, 3) providing the treatment
method of animal tissue including solid organs and whole blood for ensuring the Q-PCR reproducibility. Many developers have been on process of trial and error in developing and validating non-clinical pharmacokinetic study for plasmid DNA vector applied to fields of contagious disease, ischemic cardiovascular disease, cancer therapeutic vaccine, etc. This practical guideline of pharmacokinetic study for plasmid DNA gene therapeutics will be revised and supplemented by the consideration of advice and opinions from specialists in the related field. We think that this practical guideline will be helpful for domestic gene therapy companies to perform pharmacokinetics study for preclinical and clinical studies.

목차 Contents

• 용역연구개발과제 최종보고서 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 목 차 ... 3
• Ⅰ. 총괄연구개발과제 요약문 ... 5
• 1. 국문요약문 ... 5
• 2. 영문요약문 ... 7
• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 9
• 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ... 14
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 19
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 61
• 제5장 총괄주요연구 변경사항 ... 63
• 제6장 총괄참고문헌 ... 64
• 제7장 총괄첨부서류 ... 65
• Ⅲ. 제(1)세부연구개발과제 연구결과 ... 66
• 제1장 세부연구개발과제의 요약문 ... 67
• 제2장 세부연구개발과제의 목적 ... 70
• 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ... 75
• 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ... 80
• 제5장 세부참고문헌 ... 122