초록 ▼

면역글로불린 제제에 미량의 히스타민을 결합시켜 제조한 알러지 질환 치료제인 건조 히스타민가 사람면역글로불린은 히스타민 유리를 억제하여 히스타민의 내성을 높이고 체질을 개선시키는 피하주사제이다. 하지만 제제 내의 히스타민 함량이 많을 경우에는 각종 부작용이 발생할 수 있으며, 이를 품질관리 측면에서 엄격히 제한하고 있다. 또한 건조 히스타민가 사람면역글로불린제제에서 히스타민 양이 제제의 효능에 중요한 인자이므로 품질관리 향상을 위하여 히스타민 정량분석이 중요하다. 현재 히스타민 확인시험으로 OPA 유도체화를 이용한 시험법이 이용되고

면역글로불린 제제에 미량의 히스타민을 결합시켜 제조한 알러지 질환 치료제인 건조 히스타민가 사람면역글로불린은 히스타민 유리를 억제하여 히스타민의 내성을 높이고 체질을 개선시키는 피하주사제이다. 하지만 제제 내의 히스타민 함량이 많을 경우에는 각종 부작용이 발생할 수 있으며, 이를 품질관리 측면에서 엄격히 제한하고 있다. 또한 건조 히스타민가 사람면역글로불린제제에서 히스타민 양이 제제의 효능에 중요한 인자이므로 품질관리 향상을 위하여 히스타민 정량분석이 중요하다. 현재 히스타민 확인시험으로 OPA 유도체화를 이용한 시험법이 이용되고 있다. 제조사에서는 박층 크로마토그래피법, 국가검정으로는 형광분석법이 이용되고 있다. 이 시험법들은 그 조작이 번거롭고, 재현성, 특이성, 감도, 및 정확성에 대하여 문제점을 가지고 있으며, 제제에 함유되어 있는 히스타민의 정확한 함량을 분석하기에는 부족한 실정이다. 따라서 제제에 있는 히스타민 함량을 정확히 분석할 수 있는 정량시험법 확립이 시급하여 본 연구과제가 시행되었다. 본 연구에서는 기존에 보고된 HPLC 시험법을 SPE(solid phase extraction) 카트리지 교체를 통한 회수율개선, 형광유도체화 반응 시약 교체를 통한 검출감도 개선, 분리능 개선을 위한 HPLC 조건 변경 및 용용매의 감량을 통한 검출 감도 개선 등 시험법을 최적화 하였다. 최적화 단계에서는 SDB-L 카트리지를 사용하는 경우, NDA 형광유도체 시약 사용하는 경우, 35% acetonitrile/Phosphate buffer를 이동상으로 사용하는 경우에 가장 최적화된 분석 결과를 보였다. 시험법 검증 단계에서는 정확성은 회수율(%) 91.58 ~ 103.17 %, 정밀성은 CV (%) 2.30 %, 직선성은 평균 R2 가 표준품이 0.9931이며 Placebo spiking 샘플 경우 0.9919 값을 보였다. 특이성의 경우 시험에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 검출한계 및 정량한계는 각각 0.00758 ug/mL, 0.02296 ug/mL로 확인 되었으며, 분석 가능 범위는0.025 ~ 0.150 ug/mL로 상기 시험법이 적합함을 확인 하였다. 본시험에서는 건조 히스타민가 사람면역글로불린 완제의약품 15 로트에 대한 히스타민 함량을 제조사에서 품질관리로 사용되는 박층 크로마토그래피법, 국가검정 시험법인 형광분석법, HPLC를 이용한 형광유도체화 시험법으로 평가하였다. HPLC 시험법으로 분석한 결과, 히스타민 함량은 평균 0.083 ug/mL이며 범위는 0.074 ~0.10 ug/mL로 측정되었으며, vial(2 mL)당 함량은 평균 0.17 ug/vial(표준편차 : ±0.016, CV : 10.28 %) 이며 범위는 0.15 ~ 0.21 ug/vial로 측정되었다. 형광분석법에 대한 분석결과는 바이알 당 0.025 ug(표준편차 : ±0.013, CV : 52.27 %)이며 범위는 0.0045 ~ 0.0454 ug/vial이다. 반면 박층 크로마토그래피법은 바이알 당 0.15 ug 이하이며 이는 정성분석만 가능하였다. HPLC 시험법은 건조 히스타민가 사람면역글로불린 제제 중 히스타민 확인시험법으로 제제에 함유되어 있는 히스타민 양을 정량분석 할 수 있으며, 제조사의 품질관리 및 국가검정에 활용할 예정이다.

Abstract ▼

Freeze-dried human normal immunoglobulin with histamine, human immunoglobuin preparation combined with micro-amount of histamine(0.15 ug/vial), is used for the therapy of allergies. In case of excess histamine, the side-effects such as hypotension, hypertension, headaches, or Vanaphylactic shock may

Freeze-dried human normal immunoglobulin with histamine, human immunoglobuin preparation combined with micro-amount of histamine(0.15 ug/vial), is used for the therapy of allergies. In case of excess histamine, the side-effects such as hypotension, hypertension, headaches, or Vanaphylactic shock may be caused. It is necessary to control the specification of histamine. The methods as TLC(thin layer chromatography) and fluorescence spectrophometer are used to measure the amount of histamine. They have difficulties of the quantitative analysis to measure the amount of histamine in freeze-dried human normal immunoglobulin with histamine. In this research, Improvement and optimization of HPLC method with fluorescent derivative of histamine was performed by the change of SPE(solid phase extraction) cartridge and the reagents for fluorescent derivatives, the analytic conditions of HPLC, and the reduction of elution solution volume in SPE cartridge. Polystyren-divinylbenzene SPE cartridge showed higher recovery rate of histamine than others. NDA, a reagent for the fluorescent derivatives, was more stable than OPA. Reduction of elution solution volume made HPLC method more sensitive. In validation, accuracy(91~103.17% in the recovery rate), precision(CV 2.30%), and linearity(R2=0.9931 in histamine standard, R2=0.9919 in immunoglobulin preparions spiked with histamine) were showed. LOD was 0.00758 ug/mL and LOQ was 0.02296 ug/mL. The range of quantification was 0.025 to 0.15 ug/mL. The amount of histamine in 15 lots of freeze-dried human normal immunoglobulin with histamine was compared by TLC, fluorescence spectrometer, and HPLC. The mean value of histamine by HPLC was 0.17 ug/vial(SD : 0.016, CV : 10.28%, range : 0.15 ~ 0.21 ug/vial), which was more accurate than the mean value of 0.025 ug/vial by fluorescence spectrometer(SD : 0.013, CV : 52.27 %, 0.0045 ~ 0.0454 ug/vial). It was impossible to measure the quantitative analysis for TLC. 15 lots of freeze-dried human normal immunoglobulin with histamine were managed within the mean value ± 3 SD(0.12 ~ 0.21 ug/vial). Improved and optimized HPLC method will be used to revise the quantitative assay of histamine in the minimum requirements of biologics. It will be helpful to manage the amount of histamine in the freeze-dried human normal immunoglobulin preparations by manufacturer and in lot release.

목차 Contents

• 최종보고서 ...1
• 표지 ...2
• 국문요약문 ...4
• SUMMARY ...5
• 목차 ...6
• I. 연구개발과제 연구결과 ...7
• 제1장 연구개발과제의 개요 ...7
• 제1절 연구개발과제의 목표...7
• 제2절 연구개발과제의 필요성...7
• 제2장 연구개발과제의 국내?외 연구개발 현황 ...9
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ...10
• 제1절 연구방법...10
• 제2절 연구내용 및 연구결과...13
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...25
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...27
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ...28
• 제1절 활용성과...28
• 제2절 활용계획...28
• 제7장 참고문헌 ...29
• 제8장 첨부서류 ...30