초록 ▼

본 연구의 최종 목표는 중간엽 줄기세포를 뇌질환에 유용한 세포치료제로 개발하는 기술을 확립하고, 세포치료제로서의 중간엽 줄기세포가 임상적으로 유효성과 안정성이 있는지를 용이하게 검증할 수 있는 평가시스템을 구축함으로서 앞으로 세포치료제의 개발을 촉진할 수 있는 기반 기술을 확립하고자 한다. 이를 위하여 사람 중간엽줄기세포의 장기적 생존과 특정 기능을 가지는 신경세포로 분화 증진을 위한 외부 분화인자 들을 발굴하고(in vitro), 뇌질환 모델에서 그 효과의 평가 기술을 개발한다 (in vivo). 또한, 분화유도 전사인자를 형질전

본 연구의 최종 목표는 중간엽 줄기세포를 뇌질환에 유용한 세포치료제로 개발하는 기술을 확립하고, 세포치료제로서의 중간엽 줄기세포가 임상적으로 유효성과 안정성이 있는지를 용이하게 검증할 수 있는 평가시스템을 구축함으로서 앞으로 세포치료제의 개발을 촉진할 수 있는 기반 기술을 확립하고자 한다. 이를 위하여 사람 중간엽줄기세포의 장기적 생존과 특정 기능을 가지는 신경세포로 분화 증진을 위한 외부 분화인자 들을 발굴하고(in vitro), 뇌질환 모델에서 그 효과의 평가 기술을 개발한다 (in vivo). 또한, 분화유도 전사인자를 형질전환한 중간엽세포를 뇌질환(치매) 동물모델에 뇌이식하여 신경세포로의 분화 조건을 최적화하고 그 분화지표를 개발하며, 생존 및 분화유도인자인 신경성장 인자를 유전자 치료용 바이러스로 제조하여 중간엽세포에 감염하고 그 유효성 및 안전성을 평가한다.
2 차년도에는 사람 중간엽세포를 특정기능을 지닌 신경세포로의 분화기술을 개발하기위해 (in vitro) 분화유도 전사인자(Ngn1, Ngn2, Olig2, Nkx2.2)로 형질전환하고 신경성장인자를 처리하여 신경전달물질이나 그 수용체의 발현을 조사하고 신경줄기세포에서의 분화인자의 효과와 비교하였다.
중간엽줄기세포는 신경줄기세포와 마찬가지로 PDGF에의해 neurites가 길다란 bipolar모양으로 분화하여 neuron marker를 많이 발현하고 Nkx2.2로 형질전환한 후 PDGF를 처리하면 AMPA 수용체(GluR2)를 가지는 신경세포가 많이 발견되고, BDNF는 forskolin과 함께 처리하면 neurites를 사방으로 여러 개내는 신경세포 모양으로 분화하며 NMDA 수용체(NR2A)를 발현하는 glutamatergic neuron으로 분화하였다. 또한, 중간엽줄기세포는 신경세포에서와 달리 Ngn2과 NeuroD는 세포사멸을 많이 유도하여 효과를 볼 수없었고, Pax6가 가장 신경세포로의 분화를 많이 유도하여 neurofilament와 ChAT, calbindin, NR2A는 물론 GluR2도 많이 발현되었다. 특히 olig2와 pax6를 함께 형질전환하면 PDGF를 처리한 경우 ChAT를 많이 발현하여 콜린성 신경세포(Cholinergic neuron)로 많이 분화한 것은 주목할 만하다.
Olig2는 신경세포로 분화를 유도하지 않았으며, Shh을 처리하면 O4 발현을 유도하였다. Nkx2.2와 olig2로 함께 형질전환하고 PDGF를 넣으면 hMSC를 neuron보다 oligodendrocyte로 분화시켰다.
뇌질환 모델 흰쥐에서 분화인자를 전처리한 중간엽세포의 이식기술을 개발 및 평가(in vivo)하였다. 측뇌 entorhinal cortex에 신경독소를 주입하여 해부학적, 행동학적으로 기억력이 손상된 뇌질환모델을 제작 및 평가하였으며, 정상 및 PKA-과발현 중간엽 줄기세포를 치매동물모델에 뇌이식하여 쥐의 신경세포와 유사하게 이동과 편입 및 뇌의 세가지 세포로 분화하며 이동한 부위에 적합한 신경세포로 분화하는 것을 조사하였다. BrdU나 pHis을 염색하면 이식된 세포가 뇌에서 거의 증식하지 않았다.

Abstract ▼

- The specific aim of this project is to confirm basic techniques to facillitate the generation of theraputic stem cell by developing cell therapy using human mesenchymal stem cells(hMSCs) and developing a evaluation system testing efficacy and safety of hMSCs for therapy. For this aim of the projec

- The specific aim of this project is to confirm basic techniques to facillitate the generation of theraputic stem cell by developing cell therapy using human mesenchymal stem cells(hMSCs) and developing a evaluation system testing efficacy and safety of hMSCs for therapy. For this aim of the project, we search external factors to differentiate stem cells into neurons with long-term survival and specific functions (in vitro), and develop an evaluation skills confirming the efficacy in animal models of degenerating brain diseases.
- In the second year, we tried to define transcription factors to differentiate stem cells into neurons with long-term survival and specific functions (in vitro), and evaluate the efficacy of the cell therapy for treating brain diseases model using normal or PKA-overexpressing mesenchamal stem cells(PKA-hMSC). Therefore, we define differentiaion factors for hMSCs (in vitro), compare the efficacy with the differentiation factors for neural stem cells, and we evaluated skills for transplation and safety of hMSCs treated by differentiation factors.
- As a result of searching differentiation factors for hMSCs, we found PDGF changed the hMSC shape to bipolar with neurites, increased the expression of neuronal cell markers and AMPA receptor subunit(GluR2), specially when transfected with Nkx2.2. BDNF facillitated the differentiation into glutamatergic neuron with many neurites expressing NMDA receptor(NR2A) when treated together with forskolin. In contrast to neurons, Ngn and NeuroD induced cell death in hMSCs. Pax6 induced differentiation of hMSCs to neuron-like cells expressing neurotransmitter synthesizing enzymes and the receptors, such as neurofilament, ChAT, calbindin, NR2A as well as GluR2. Interestingly, when transfected with pax6 and Olig2 and treated with PDGF, hMSCs changed into cholinergic cells expressing ChAT.
- Development of techniques transplanting normal and PKA-overexpressing hMSCs preteated with differentiation factors and evaluation of safety. We evaluated degenerating animal models with memory impaiment histologically and behaviorally. We found normal and PKA-overexpressing hMSCs migrate, integrate into tissue with improved cell survival rate, and differentiate into three cell types in the brain, and differentiates into neural cell types, proper to the final location.

목차 Contents

• 제출문 ...1
• 요약문 ...2
• Project Summary ...3
• 목차 ...4
• 제1장 서론 ...5
• 제1절 연구개발의 목적 및 필요성 ...5
• 제2절 연구개발의 필요성 ...7
• 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...12
• 제1절 외국의 경우 ...12
• 제2절 국내의 경우 ...16
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...18
• 제1절 연구내용 ...18
• 제2절 연구내용에 대한 이론적, 실험적 접근 ...21
• 제3절 연구 결과 ...26
• 제4장 연구결과에 대한 기여도, 기대효과 및 활용방안 ...39
• 4.1 연구결과의 기여도...39
• 4.2 기대효과...39
• 4.3 활용방안...40
• 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...41
• 가. 계량적 성과...41
• 나. 성과내용기술...41
• 다. 활용계획...43
• 제6장 기타 중요변경사항 ...43
• 제7장 참고문헌 ...43
• 총괄 연구과제 요약 ...46