보고서 정보
주관연구기관 |
성균관대학교 의과대학 Sungkyukwan University |
연구책임자 |
궁미경
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참여연구자 |
강희규
,
전진현
,
이형송
,
임천규
,
양혜영
,
홍석호
,
나희영
,
최혜원
,
성지혜
,
신현상
,
최승준
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2003-11 |
과제시작연도 |
2003 |
주관부처 |
식품의약품안전청 |
과제관리전문기관 |
식품의약품안전청 |
등록번호 |
TRKO201000016422 |
과제고유번호 |
1470001510 |
사업명 |
식품의약품안전성관리 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
배아줄기세포.분화 유도.인슐린 분비세포.세포치료제.유효성.Embryonic stem cells.Induced differentiation.Insulin secretory cells.Cell therapy.
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초록
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초기 배아의 미분화된 내세포괴에서 유래한 배아줄기세포는 성체 여러 조직의 특이 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이를 이용한 세포치료의 가능성이 대두되고 있다. 이러한 배아줄기세포를 이용한 세포치료에 대한 모델시스템의 개발은 세포치료의 임상적용 이전에 선행되어야 하는 중요한 연구 분야로서 핵심적인 관련 기반 기술과 임상적인 평가 기준 개발에 필수적인 것으로 생각된다.
본 연구는 생쥐 및 인간의 배아줄기세포를 인슐린 분비세포로 분화 유도하고, 이를 이용한 세포치료에서의 유효성 평가를 통해, 배아줄기세포를 이용한 세포
초기 배아의 미분화된 내세포괴에서 유래한 배아줄기세포는 성체 여러 조직의 특이 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이를 이용한 세포치료의 가능성이 대두되고 있다. 이러한 배아줄기세포를 이용한 세포치료에 대한 모델시스템의 개발은 세포치료의 임상적용 이전에 선행되어야 하는 중요한 연구 분야로서 핵심적인 관련 기반 기술과 임상적인 평가 기준 개발에 필수적인 것으로 생각된다.
본 연구는 생쥐 및 인간의 배아줄기세포를 인슐린 분비세포로 분화 유도하고, 이를 이용한 세포치료에서의 유효성 평가를 통해, 배아줄기세포를 이용한 세포치료제의 약리 및 임상 평가를 위한 기준과 기술 개발을 목표로 하고 있다.
생쥐 및 인간의 배아줄기세포를 인슐린 분비세포로 유도 분화시키기 위해 배양액에 여러 가지 기능성 물질들을 첨가하여 단계적 배양을 실시하였다. 일차적으로 부유 배양법을 이용하여 미분화 줄기세포에서 배아체 (embryoid body)의 형성을 유도하고, 이를 insulin, transferrin, sodium selenate, fibronectin 등이 첨가된 ITSFn 배양액에서 6일 동안 배양하고 (Stage-I), nicotinamide, insulin, EGF, FGF 등이 첨가된 N2 배양액 또는 insulin 대신에 IGF-I과 IGF-II를 첨가한 N2-insulin free 배양액에서 각각 8일 동안 배양하였다 (Stage-II). 마지막 단계에서는 N2, N2+B27, N2-insulin free 등의 배양액에서 각각 22일 동안 배양하였다 (Stage-III). 여러 개의 배아체를 동시에 배양하거나, 하나의 배아체를 단독으로 배양하면서 그 형태적인 변화와 분화 관련 유전자의 발현 연관성을 살펴보았다. 각각의 단계에서 분화에 따른 세포의 변화를 알아보기 위해 세포표면의 당 잔기에 결합하는 lectin을 이용하여 세포 표면의 당 잔기의 변화 양상을 관찰하였다. 또한, 미분화세포들이 인슐린 분비세포로 분화됨을 확인하기 위해 인슐린 분비세포를 포함하는 내배엽성 세포로의 분화 인자들에 대한 유전자 발현 양상을 RT-PCR 방법으로 확인하였으며, 최종 단계에서는 배양액에 분비된 인슐린의 양을 RIA 방법으로 측정하였다. 분화세포들의 생체내에서의 기능을 확인하기 위해 인슐린 분비세포로 분화 유도된 세포들을 alloxan을 주사하여 만든 당뇨 쥐에 이식하였다.
배아체의 배양 과정에서 세포들이 여러 가지 형태로 분화되었으며, 각각의 형태적인 특성과 유전자 발현 양상은 관련성이 있음을 확인할 수 있었다. 미분화 상태의 배아줄기세포에서 특정 세포로 분화되어 감에 따라 세포 표면의 당 잔기의 변화가 관찰되었으며, 생쥐와 인간의 배아줄기세포에서 종특이성에 의해 상이한 양상을 나타내었다. 분화 인자들의 발현 양상을 살펴보면 Oct-4와 같은 미분화 인자들은 분화과정에서 점차적으로 감소되었으며, GATA-4, alpha fetoprotein, glucose transporter-2, Ngn-3 등과 같은 내배엽성 분화 인자들의 발현이 점차적으로 증가하였다. 또한, albumin과 insulin에 대한 mRNA는 생쥐 배아줄기세포에서는 Stage-II에서, 인간 배아줄기세포에서는 Stage-III에서 그 발현이 확인되었다. 최종적으로 분화시킨 인간의 배아줄기세포(Stage-III)의 인슐린 분비양은 2.91 - 43.0 microU/ml 이었으며, 현재 당뇨 쥐에 생쥐 및 인간의 배아줄기세포에서 유도 분화시킨 세포를 이식한 후 혈당 측정을 통해 그 효용성을 확인하고 있다.
Abstract
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Embryonic stem (ES) cells are established from inner cell mass of blastocyst in mouse and human. They could be differentiated into the specific cell types and used for cell therapy of degenerative diseases. Prior to the clinical application, the model system of cell therapy using human ES cells shou
Embryonic stem (ES) cells are established from inner cell mass of blastocyst in mouse and human. They could be differentiated into the specific cell types and used for cell therapy of degenerative diseases. Prior to the clinical application, the model system of cell therapy using human ES cells should be developed by defined criteria and evaluated the effectiveness of the therapy.
In this study, we want to develop the criteria for cell therapy using human ES cells in the diabetes model. Mouse and human ES cells were sequentially cultured with various supplements for differentiation into insulin secretory cells. Undiifferentiated ES cells were formed embryoid bodies (EBs) by suspension culture, and then EBs were culture for 6 days with ITSFn medium containing insulin, transferrin, sodium selenate and fibronectin (Stage-I). In Stage-II, the cells of Stage-I were cultured with N2 medium containing nicotinamide, insulin, EGF and FGF or with N2-insulin free medium, IGF-I and -II replaced insulin, for 8 days. Finally, the cells of Stage-II were respectively cultured with N2, N2+B27 and N2-insulin free medium for further 22 days. The relationship between morphological characteristics and marker genes expression was assessed in single or multiple EBs culture system. Changes of cell surface sugar residues during the differentiation of ES cells were observed by lectin binding assay. Expression of marker genes of endodermal lineage, including insulin secretory cells, was analyzed by semiquantitative or real time RT-PCR in each stage of differentiation. The amount of secreted insulin from differentiated cells of Stage-III was measured by RIA. For the functional analysis of differentiated cells, the cells were transplanted to the diabetic rats by alloxan injection.
EBs could be differentiate to the various cell types, and we found the relationship between morphological characteristics and marker gene expressions. Lectin binding patterns changed during the differentiation process. Some differences of lectin binding patterns were observed between mouse and human ES cells by species specific manner. Several marker gene expressions of endodermal lineage, GATA-4, alpha fetoprotein, glucose transporter 2 and Ngn-3, were increased whereas Oct-4 was decreased progressively after EB formation. We detected 2.9 - 43.0 microU/ml of secretory insulin from differentiated human ES cells (Stage-III). Therapeutic potential of differentiated ES cells is currently investigating by using the cell transplantation model of alloxan injected diabetic rats.
목차 Contents
- 용역연구개발사업최종보고서 ...1
- 제출문 ...2
- 연구사업 최종보고서 요약문 ...3
- Project Summary ...4
- 목차 ...5
- 제1장 서론 ...6
- 가. 연구개발의 목적 및 필요성 ...6
- 나. 연구개발의 내용 및 범위 ...7
- 제2장 국내·외 기술개발 현황 ...8
- 가. 배아줄기세포에 관한 국내·외 연구 동향 ...8
- 나. 줄기세포를 이용한 당뇨병 치료에 대한 국내·외 연구 동향 ...9
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...11
- 가. 연구내용 및 방법 ...11
- 나. 연구 결과 ...16
- 다. 연구내용 및 성과 ...23
- 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...24
- 가. 연구개발목표 달성도 ...24
- 나. 대외기여도 ...24
- 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...25
- 가. 개량적 성과 ...25
- 나. 성과내용기술 ...25
- 다. 활용계획 ...25
- 제6장 기타 중요변경사항 ...27
- 제7장 참고문헌 ...28
- 총괄 연구과제 요약 ...30
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