초록 ▼

첫째는 본 연구팀에서 M. xanthus Protox 유전자를 이용하여, 개발한 Peroxidizing 저항성벼의 세대간 안정성(T2, T3, T4)이 유지되는 지를 조사하며, 벼 재배지에서 효과적으로 사용될 수 있는 제초제의 농도 및 시기를 규명하고, homozygous lines의 세대진전에 따라 안정적으로 유전자가 발현되는지 및 제초제 저항성이 지속적으로 유지되는 지를 아울러 조사한다. 또한 T2, T3, T4 세대에서의 제초제저항성 형질전환벼의 생육특성 및 수량에 영향을 미치는지를 조사한다. 제초제저 항성벼의 포장단위 실험을

첫째는 본 연구팀에서 M. xanthus Protox 유전자를 이용하여, 개발한 Peroxidizing 저항성벼의 세대간 안정성(T2, T3, T4)이 유지되는 지를 조사하며, 벼 재배지에서 효과적으로 사용될 수 있는 제초제의 농도 및 시기를 규명하고, homozygous lines의 세대진전에 따라 안정적으로 유전자가 발현되는지 및 제초제 저항성이 지속적으로 유지되는 지를 아울러 조사한다. 또한 T2, T3, T4 세대에서의 제초제저항성 형질전환벼의 생육특성 및 수량에 영향을 미치는지를 조사한다. 제초제저 항성벼의 포장단위 실험을 지속하여 수도에서 사용가능한 peroxidizing 제초제의 종류와 약량 검정을 통하여, 장차 실제농가에 사용할 수 있는 제초제실증실험의 예비 자료를 얻고자 함이며, 둘째는 제초제 저항성을 최대한 발휘할 수 있도록 합성유전자를 제조하고 이를 이용하여 형질전환 벼를 육성하고자 한다. 471개의 아미노산에 1416 bp 길이(TAA 포함)를 가진 M. xanthus 유전자는 GC 함량(70%)이 매우 높아서 식물에 도입되었을 경우 발현량이 낮은 단점이 있으므로, 높은 GC 함량을 식물수준에 맞도록 조정하고(>50%), codon usage를 식물 유전자와 유사하게 바꾸어줌으로, M. xanthus Protox의 발현량을 식물체에서 가장 적절하게 발현되게 함으로 제초제 저항성효과를 극대화하는 실험을 하고자 한다.
구체적인 실험 방법을 요약하면 다음과 같다.
。합성 Protox 유전자를 만들기 위해 70-80 mer primers를 24-32개를 합성하여, bridge 연결방법식으로 유전자를 합성하고자 한다(Donohue et al. 1995).
。합성된 M. xanthus Protox 유전자가 효과적으로 translation 되는지를 대장균(E. coli) 발현 vector을 사용하여 검정하며, 또한 효소활성이 있는지 정제된 Protox 단백질을 사용하여 측정 한다.
。효소활성이 정상인지를 확인한 후 binary vector에 도입하여 벼에 형질전환한다.
。형질전환은 Agrobacterium 매개 방법을 이용한다.
。형질전환벼가 확보되면, 합성 유전자의 발현이 제초제 저항성을 얼마나 높이는지 제초제 저항성 검정을 한다.
。합성 Protox 단백질이 엽록체 및 미토콘드리아에 발현되는지, 효소활성이 natural Protox 발현 형질전환벼에 비해 얼마나 발현되는지 등의 세포생물학적 방법을 사용한다.
。형질전환벼의 생육 안정성, 수량지표 및 제초제 저항성 반응 등을 검정한다.

Abstract ▼

In our previous study, we had generated transgenic rice plants expressing a native Protox of M. xanthus which conferred a high resistance against peroxidizing herbicides. In our continuation of this study, we would like to investigate this herbicide resistance from generation to generation ranging f

In our previous study, we had generated transgenic rice plants expressing a native Protox of M. xanthus which conferred a high resistance against peroxidizing herbicides. In our continuation of this study, we would like to investigate this herbicide resistance from generation to generation ranging from T2 to T4. In addition, we will check optimum herbicide concentration for weed control in paddy field in order to maximize the utilization of the transgenic rice plants. During our study, we will also measure the productivity of transgenic rice plants throughout several generation. Another key goal is to synthesize a M. xanthus Protox gene by using synthetic oligo nucleotides. This synthetic Mx Protox harbors a similar codon usage to plant Protox gene and similar G+C contents which resembles a plant-like gene. After making the synthetic Mx Protox gene, we will introduce this synthetic gene into rice genome to produce transgenic rice plants. Then, we will compare herbicide resistance between a native Mx Protox and synthetic Mx Protox harboring rice plants. Also, we will try to develop a new system for rice transformation using a Mx Protox as a selectable marker gene and peroxidizing herbicides as selection agents. Followings are experimental scopes in details.
。Construction of a synthetic gene encoding Myxococcus xanthus Protox protein
。Bacterial expression studies and enzyme purification of a synthetic Mx Protox
。Antibody preparation and immunoblot analysis using a synthetic Mx Protox
。Binary Vector construction and rice transformation
。Protoporphyrinogen oxidase activity and protoporphyrin IX content
。Agronomic traits on transgenic rice plants expressing a native Mx Protox
。Agronomic traits on transgenic rice plants expressing a synthetic Mx Protox
。Herbicide performance transgenic rice plants in field
。Calli viability test in response to various peroxidizing herbicides
。Vector construction and rice transformation using a Mx Protox/Butafenacil system
。Molecular analysis of transgene integration and expression
。Leaf disk and foliar spray assays for butafenacil resistance

목차 Contents

• 제출문 ...2
• 요약문 ...3
• SUMMARY ...9
• CONTENTS ...13
• 목차 ...14
• 제1장 연구개발과제의 개요 ...18
• 제1절 연구개발의 목적 및 필요성 ...18
• 제2절 연구개발 범위 ...20
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ...24
• 제1절 본 연구진의 선행연구결과 ...24
• 제2절 국내.외 타 연구기관의 연구내용 및 결과 ...24
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...26
• 제1절 Myxococcus xanthus Protox 유전자의 화학적 합성 및 형질전환벼 육성 ...26
• 1. 서 설 ...26
• 2. 연구 수행 방법 ...27
• 가. 합성 유전자 design 및 Protox 유전자 합성 ...27
• 나. 대장균 발현 및 Protox 효소활성 측정 ...28
• 다. 벼에서 엽록체 및 미토콘드리아 분리 ...28
• 3. 연구 수행 결과 ...29
• 가. 식물의 선호 코돈으로 변환한 M. xanthus 유래의 프로토포르피리노겐 옥시다아제(Protox) 유전자의 합성 ...29
• 1) 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 염기서열 설계 ...29
• 2) 이중가닥 DNA 단편의 제작을 위한 단일가닥 올리고뉴클레오타이드의 합성 ...30
• 3) 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 합성하기 위한 이중가닥 DNA 단편의 제조 ...31
• 4) 이중가닥 DNA 단편의 벡터로의 클로닝 및 염기서열 확인 ...33
• 5) 전장(full length) 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자의 합성 ...33
• 나. 합성유전자의 대장균발현 및 항체획득 ...38
• 제2절 합성 M. xanthus Protox 유전자를 발현하는 형질전환벼의 제초제 저항성 검정 ...42
• 1. 서 설 ...42
• 2. 연구 수행 방법 ...42
• 가. 합성 Protox 발현 형질전환벼 육성 ...42
• 나. 합성 Protox 유전자 발현 형질전환벼 육성 및 T1 종자 획득 ...43
• 다. Southern blot 및 Northern blot 발현 분석 ...43
• 라. 과산화작용 제초제 발아 저항성 검정 ...43
• 마. 합성 Protox 발현 T1 형질전환체 종자의 유전력 검정 ...44
• 바. 형질전환벼의 제초제 반응 ...44
• 사. Western blot 분석 ...44
• 아. 단백질 targeting을 위한 완두로부터 미토콘드리아 및 엽록체 분리 ...44
• 자. 단백질 targeting을 위한 Dual import 분석 ...45
• 차. Protoporphyrinogen oxidase(Protox) 효소활성 측정 ...46
• 3. 연구 수행 결과 ...46
• 가. 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제 유전자를 이용한 벼의 형질전환 ...46
• 1) 벼 형질전환용 벡터의 제조 ...46
• 2) 벼 형질전환 및 재분화 ...47
• 나. 식물의 선호 코돈으로 변환한 M. xanthus 유래의 합성 프로토포르피리노겐 옥시다아제(Protox) 유전자의 특성 ...47
• 다. 합성 Protox 유전자 발현 형질전환벼의 유전력 검정 ...47
• 라. 합성 Protox 발현 형질전환벼의 transgene 유전자의 게놈 삽입수 분석 ...49
• 마. 합성 Protox 발현 형질전환벼의 mRNA 합성량 분석 ...49
• 바. 합성 Protox 발현 형질전환벼와 native Protox 발현 형질전환벼와의 초기생장 비교 분석 ...50
• 사. 암상태에서 합성 Protox 발현벼와 native Protox 발현 형질전환벼와의 초기생장 비교 분석 ...50
• 아. 합성 Protox 발현 T1 세대에서 제초제저항성 발아 검정 ...51
• 자. 합성 Protox 발현 T1 세대에서 제초제저항성 경엽처리 검정 ...51
• 차. 합성 Protox 발현 T1 세대에서 salt 저항성 발아 검정 ...51
• 카. 합성 Protox 효소활성 검정, 형질전환벼 육성 및 Southern blot 분석 ...52
• 타. 합성 및 native Protox 발현 형질전환벼의 Protox 발현 분석 ...52
• 파. 합성 Protox 발현 형질전환벼와 native Protox 발현 형질전환벼와의 제초제 저항성 비교분석 ...53
• 하. 합성 Mx Protox의 import assay 및 형질전환벼로부터 organells 분리를 통한 dual targeting 분석 ...54
• 제3절 Mx protox 유전자를 selectable marker gene으로서 이용 및 형질전환벼 육성 ...71
• 1. 서 설 ...71
• 2. 연구 수행 방법 ...71
• 가. Scutellum 유도 벼 calli 의 과산화작용 제초제에 대한 민감도(Susceptibility) 검정 ...71
• 나. pCAMBIA0380-Syn MX Protox 벡터 구조물 구축 ...72
• 다. Butafenacil을 이용한 옆 절편 및 foliar 처리에 의한 제초제 저항성 검정 ...72
• 3. 연구 수행 결과 ...72
• 가. 과산화작용 제초제들에 대한 벼 calli의 susceptibility 정도 검정 ...72
• 나. T-DNA 내에 Mx Protox DNA만 함유하는 binary vector 제작 ...73
• 다. Butafenacil을 선발화합물로 이용한 형질전환벼의 선발 및 재분화 과정 ...73
• 라. Butafenacil 선발에 의해 재분화된 형질전환벼의 Northern blot 및 Western blot 분석 ...74
• 마. Butafenacil 선발에 의해 재분화된 형질전환벼의 제초제저항성 분석 ...74
• 제4절 Mx Protox 발현 형질전환벼의 생육 및 포장안정성 검정 ...81
• 1. 서 설 ...81
• 2. 연구 수행 방법 ...82
• 가. T3 세대 형질전환 벼(native Mx Protox 발현)의 포장 수량성 검정 ...82
• 나. T4 세대 형질전환벼(native Protox 발현)의 GR50 값(지상부 생체중이 50% 감소하는 제초제 농도)에 의한 제초제 저항성 정도 평가 ...82
• 다. 형질전환벼(native Protox 발현)의 T4 세대의 생육시기 별 생장반응 ...83
• 라. 형질전환벼(native Protox 발현)의 T4 세대의 관행재배에 따른 수량성 ...83
• 마. 논 포장조건하에서 native Protox 발현 형질전환 벼(T4 세대)의 제초제 반응 ...83
• 바. 세포내 구성물질의 누출 ...83
• 사. 세포막 지질과산화작용 ...84
• 아. 논 포장재배 조건하에서 대면적 관행재배에 따른 native Protox 발현 형질전환 벼(T5 세대)의 수량성 ...84
• 자. Native Protox 발현 형질전환벼에 대한 Protox 저해 제초제의 GR50 농도 처리에 따른 생리적 반응 비교 ...84
• 차. T2 세대 형질전환 벼(합성 Mx Protox 발현)의 포장 수량성 검정 ...86
• 3. 연구 수행 결과 ...86
• 가. Native M. xanthus Protox 발현 T3 형질전환벼의 수량성 측정 ...86
• 나. 벼의 잎으로부터 엽록체 및 미토콘드리아 분리 ...87
• 다. 형질전환벼의 세대 안정성 측정을 위한 hygromycin leaf disk assay ...88
• 라. Native M. xanthus Protox 발현 T4 세대 형질전환 벼의 GR50 값(지상부 생체중이 50% 감소하는 제초제 농도)에 의한 제초제 저항성 정도 평가 ...90
• 마. 형질전환 벼(native Protox 발현)의 T4 세대의 생육시기 별 생장반응 ...93
• 바. 형질전환 벼(native Protox 발현)의 T4 세대의 관행재배에 따른 수량성 ...94
• 사. 논 포장조건하에서 native Protox 발현 형질전환 벼(T4 세대)의 제초제 반응 ...94
• 아. Protox 저해 제초제에 대한 비형질전환 벼(재배종 동진벼)와 형질전환 벼(native Protox 발현)의 생리적 반응 비교 ...96
• 자. 논 포장재배 조건하에서 대면적 관행재배에 따른 native Protox 발현 형질전환 벼(T5 세대)의 수량성 ...100
• 차. Native Protox 발현 형질전환 벼에 대한 Protox 저해 제초제의 GR50 농도 처리에 따른 생리적 반응 비교 ...101
• 카. T2 세대 형질전환 벼(합성 Mx Protox 발현)의 포장 수량성 검정 ...108
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...111
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ...113
• 제1절 연구 성과 ...113
• 제2절 타 연구에의 응용 ...114
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ...115
• 가. 2003년: 과산화작용 제초제저항성 애기장대 Protox 제조 및 이를 이용한 형질전환옥수수 육성 ...115
• 나. 2005년: 과산화작용제초제 저항성 작물개발 review...115
• 다. 2005년: 형질전환제초제 저항성 작물의 현황과 미래...115
• 제7장 참고문헌 ...116