초록 ▼

1. 토양 거대 DNA의 분리법 확립 및 메타제놈은행 구축
。토양 시료의 채취 및 특성 검정
。토양 거대 DNA 분리법 확립
。메타제놈 은행 구축
2. 메타제놈 은행으로부터 biotic 및 abiotic stress 관련 유전자 선발
。식물 병원균 세포벽 분해 관련 chitinase 유전자 선발 및 활성영역 동정
。식물 병원균 세포벽 분해 관련 cellulase 및 β-glucosidase 생산 관련 유전자 선발 및 활성 영역 동정
。내염성 관련 유전자 선발
。Biosurfactant 생산

1. 토양 거대 DNA의 분리법 확립 및 메타제놈은행 구축
。토양 시료의 채취 및 특성 검정
。토양 거대 DNA 분리법 확립
。메타제놈 은행 구축
2. 메타제놈 은행으로부터 biotic 및 abiotic stress 관련 유전자 선발
。식물 병원균 세포벽 분해 관련 chitinase 유전자 선발 및 활성영역 동정
。식물 병원균 세포벽 분해 관련 cellulase 및 β-glucosidase 생산 관련 유전자 선발 및 활성 영역 동정
。내염성 관련 유전자 선발
。Biosurfactant 생산 관련 유전자 분리 및 활성영역 동정
3. 선발 유전자의 발현 증진을 위한 시스템 개발
。High-throughput screening을 위한 선발 유전자의 bacterial cell surface 디스플레이
。선발 유전자의 in-vitro 분자 진화에 의한 기능성 효율 증진
- Mutator cell을 이용한 BglA의 in-vitro mutagenesis 및 mutant 선발
- Error-prone PCR을 이용한 BglA의 in-vitro mutagenesis 및 mutant 선발
4. 토양 DNA의 세균 다양성 및 분포해석
。토양 내에 서식하는 다양한 세균의 분리, 동정 및 보존
。비 배양 방법을 통한 토양세균의 다양성 분석 및 우점종 확인
。선발된 신규 미생물의 다상적 계통분류 연구

Abstract ▼

Part I. Evaluation of high-molecule DNA recovery and construction of metagenomic libraries
。Soil collection and characterization
。Evaluation of high-molecule DNA recovery from soil samples
。Construction and characterization of metagenomic libraries
Part II. Isolation of biotic & abiotic

Part I. Evaluation of high-molecule DNA recovery and construction of metagenomic libraries
。Soil collection and characterization
。Evaluation of high-molecule DNA recovery from soil samples
。Construction and characterization of metagenomic libraries
Part II. Isolation of biotic & abiotic related genes from metagenomic libraries
。Screening and identification of active region from chitinase eDNA clone
。Screening and identification of active regions from cellulase and β -glucosidase producing eDNA clones
。Selection and assay of salt tolerance eDNA clones and eDNA selection of proline-overproduction
。Screening and selection of biosurfactant-related metagenomic clones
Part III. Development of enhanced expression systems from isolated genes.
。Evaluation of expression efficiency for high-throughput screening
。Evolution of an isolated gene for enhancement of activities
Part IV. Diversity analysis of bacteria and soil DNA
。Isolation, identification and preservation of diverse bacteria from soil
。Diversity analysis of soil DNA by culture-independent methods
。Classification of selected bacteria by polyphasic approach

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 요약문...3
• SUMMARY...12
• CONTENTS...20
• 목차...23
• 제 1 장 연구개발과제의 개요...29
• 제1절 연구개발의 목적 및 필요성...29
• 1. 연구개발의 목적...29
• 2. 연구개발의 필요성...29
• 제2절 연구개발의 내용 및 범위...31
• 1. 연구개발의 목표...31
• 2. 연구개발의 내용 및 범위...32
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...33
• 1. 국외의 기술개발 현황...33
• 2. 국내의 기술개발 현황...33
• 3. 앞으로의 전망...34
• 제 3 장 연구개발 수행내용 및 결과...35
• 제1절 토양 거대 DNA의 분리법 확립 및 메타제놈은행 구축...35
• 1. 토양 시료의 채취 및 특성 검정...35
• 가. 연구수행 내용 및 방법...35
• 1) 연구내용...35
• 2) 연구방법...35
• 나. 연구 결과...36
• 1) 토양시료 채취 결과...36
• 2) 토양시료 분석 결과...36
• 2. 토양 거대 DNA 분리법 확립...39
• 가. 연구수행 내용 및 방법...39
• 1) 연구내용...39
• 2) 연구방법...39
• 가) 토양시료로부터 균체집적 및 전처리...39
• 나) 토양시료의 동결건조 여부에 따른 DNA 추출...39
• 다) 토양 DNA 추출법 비교...40
• 라) 토양 DNA 정제법 비교...40
• 마) 분리한 토양 DNA의 정제도 측정...41
• 나. 연구 결과...42
• 1) 토양 DNA 추출...42
• 가) 토양시료의 동결건조 여부에 따른 DNA 추출...42
• 나) 추출 방법에 따른 DNA 분리 비교...44
• 다) 정제 방법에 따른 DNA 분리 비교...48
• 3. 메타제놈 은행 구축...52
• 가. 연구수행 내용 및 방법...52
• 1) 연구내용...52
• 2) 연구방법...52
• 가) 메타제놈 은행 제작...52
• 나. 연구 결과...54
• 1) 메타제놈 은행 제작...54
• 제2절 메타제놈 은행으로부터 biotic 및 abiotic stress 관련 유전자 선발...57
• 1. 식물 병원균 세포벽 분해 관련 chitinase 유전자 선발...57
• 가. 연구수행 내용 및 방법...57
• 1) 연구내용...57
• 2) 연구방법...57
• 가) 식물병원균에 대한 항균효소 chitinase 생성 clone 탐색...57
• 나. 연구결과...62
• 1) Chitinase활성 eDNA 탐색 및 활성영역 구명...62
• 가) Chitinase 생산 클론의 선발...62
• 나) Chitinase 활성영역의 분리...66
• 다) Chitinase 활성 eDNA clone의 식물병원진균에 대한 길항성...70
• 라) Chitinase 활성영역의 분자구조 분석...72
• 마) eDNA 유래 chitinase 유전자의 발현분석...78
• 2. 식물 병원균 세포벽 분해 관련 cellulase 및 β-glucosidase 생산 관련 유전자 선발...82
• 가. 연구수행 내용 및 방법...82
• 1) 연구내용...82
• 2) 연구방법...82
• 가) 식물병원균에 대한 항균효소 cellulase 및 β-glucosidase 생성 clone 탐색...82
• 나) 선발 클론의 shot-gun library 제조 및 재탐색...82
• 다) DNA 염기서열 및 상동성 분석...83
• 라) 유전자의 과발현 및 정제...83
• 마) 효소 활성 측정...83
• 바) 유전자 산물의 확인...84
• 사) Thin layer chromatography (TLC) analysis...84
• 아) HPLC analysis...84
• 나. 연구결과...85
• 1) Cellulase 유전자의 분리 및 활성영역 동정...85
• 가) Cellulase 생산 클론의 선발...85
• 나) Cellulase 생산 유전자의 염기서열 분석 및 상동성 조사...88
• 2) β-Glucosidase 유전자 분리 및 활성영역 동정...91
• 가) β-Glucosidase 생산 클론의 선발...91
• 나) β-Glucosidase 생산 클론의 유전자의 염기서열 분석 및 상동성 조사...94
• 다) BglA 정제와 생화학적 특성...96
• 라) BglA의 ginsenoside 전환...101
• 3. 내염성 관련 유전자 분리...104
• 가. 연구수행 내용 및 방법...104
• 1) 연구내용...104
• 2) 연구방법...104
• 가) 내염성 eDNA clone 선발...104
• 나) Proline-overproduction eDNA clone의 screening...104
• 나. 연구결과...105
• 1) 내염성 eDNA clone 선발 및 분석...105
• 2) Proline-overproduction eDNA clone 선발...108
• 가) eDNA library 으로부터의 prolin-overproduction clone 분리...108
• 나) PCR증폭에의한 Metagenome DNA로부터 proAB 유전자 분리...109
• 4. Biosurfactant 생산 관련 유전자 분리 및 활성영역 동정...114
• 가. 연구수행 내용 및 방법...114
• 1) 연구내용...114
• 2) 연구방법...114
• 가) Biosurfactant 생산 관련 유전자 탐색...114
• 나) 선발 클론의 활성 negative Tn 돌연변이체의 선발...116
• 다) 선발 클론의 shot-gun library 제조 및 재탐색...116
• 라) DNA 염기서열 및 상동성 분석...117
• 나. 연구결과...117
• 1) Biosurfactant 생산 클론의 선발...117
• 가) Drop collapse method를 이용한 검색...117
• 나) Blood agar lysis를 이용한 검색...118
• 다) Tributyrin 첨가배지를 이용한 검색...120
• 라) 토양에서 분리한 균주로부터 biosurfactant 생산 균주 검색...126
• 제3절 선발 유전자의 발현 증진을 위한 시스템 개발...128
• 1. High-throughput screening을 위한 선발 유전자의 bacterial cell surface display...128
• 가. 연구수행 내용 및 방법...128
• 1) 연구내용...128
• 2) 연구방법...129
• 가) Bacterial strain, plasmid 및 배지...129
• 나) 유전자 cloning...129
• 다) E. coli에서의 BglA 표면 발현 및 활성 측정...129
• 나. 연구결과...130
• 1) Bacterial cell surface display를 위한 bglA 유전자의 pGF101 vector로의 cloning...130
• 2. 선발 유전자의 in-vitro 분자 진화에 의한 기능성 효율 증진...135
• 가. 연구수행 내용 및 방법...135
• 1) 연구내용...135
• 2) 연구방법...136
• 가) Mutator cell에 의한 random-mutagenesis...136
• 나) Error-prone PCR을 이용한 random mutagenesis...137
• 다) 선발한 클론들의 β-glucosidase 활성 측정...137
• 나. 연구결과...138
• 1) Mutator cell을 이용한 BglA의 in-vitro mutagenesis 및 mutant 선발...138
• 2) Error-prone PCR을 이용한 BglA의 in-vitro mutagenesis 및 mutant 선발...142
• 제4절 토양 DNA의 세균 다양성 및 분포해석...146
• 1. 토양 내 다양한 세균의 분리, 동정 및 보존...146
• 가. 연구수행 내용 및 방법...146
• 1) 연구내용...146
• 2) 연구방법...146
• 가) 저영양배지를 이용한 배양 가능한 세균의 분리 최대화...146
• 나) 분리된 세균의 16S rRNA를 이용한 분류...148
• 다) 특성에 따른 배양 가능한 세균의 분포 해석...149
• 라 )세균의 다양성확보에 의한 미생물 자원의 보전...149
• 나. 연구결과...150
• 1) 저영양배지를 이용한 세균의 분리 최대화...150
• 2) 분리된 세균의 지방산 분석을 이용한 분류 및 분포해석...151
• 가) 생태계 보존 지역에서 분리한 토양 미생물 다양성...151
• 나) 고추재배지에서 분리한 미생물의 분류, 동정...154
• 3) 16S rRNA를 이용한 토양 세균의 분류 및 분포해석...155
• 가) 서해안 갯벌 시료에서 배양 분리한 균주의 동정과 분포...155
• 나) 포항연안지에서 분리한 세균의 동정 및 분포율...155
• 다) 원주 토양에서 분리한 세균의 동정 및 분포율...155
• 2. 비 배양 방법을 통한 토양세균의 다양성 분석 및 우점종 확인...159
• 가. 연구내용 및 방법...159
• 1) 연구내용...159
• 2) 연구방법...159
• 가) 다양한 토양의 DNA 추출...159
• 나) 16S rRNA를 이용한 토양세균의 다양성 분석...159
• 다) 배양 불가능한 미생물의 분류, 우점종 확인 및 분포 해석비교...159
• 나. 연구결과...163
• 1) 생태계 보존지역의 토양 DNA 분포해석...163
• 가) 우포늪 토양DNA의 미생물 다양성 분석...163
• 나) 무제치늪 토양DNA의 미생물 다양성 분석...164
• 2) 고추재배 국내 농경지의 토양DNA 분포해석...165
• 가) 고추재배지 병 건전지역 토양DNA의 미생물 다양성 분석...165
• 나) 고추재배지 병 발생지역 토양DNA의 미생물 다양성 분석...166
• 3) 서해안 갯벌 (대부도) 시료에서 추출한 토양 DNA의 미생물 다양성 분석...167
• 4) 포항연안지에서 추출한 토양DNA의 미생물 다양성 분석...168
• 5) 원주 토양에서 추출한 토양DNA의 미생물 다양성 분석...169
• 3. 선발된 신규 미생물의 다상적 계통분류 연구...170
• 가. 연구수행 내용 및 방법...170
• 1) 연구내용...170
• 2) 연구방법...170
• 가) 선발된 균주의 16S rRNA분석...170
• 나) 형태적 특성 조사...170
• 다) 생리학적 특성조사...170
• 라) G+C 함량 측정...171
• 마) 지방산(fatty acid) 분석...171
• 바) Quinone분석...171
• 사) Phylogenetics...171
• 나. 연구결과...172
• 1) Pseudomonas pohangensis sp. nov., isolated from seasand in Korea...176
• 2) Idiomarina homiensis sp. nov., isolated from seashore sand in Korea...178
• 3) Loktanella koreensis sp. nov., isolated from seasand in Korea...180
• 4) Exiguobacterium homiense sp. nov., isolated from seasand in Korea...182
• 5) Marinobacter koreensis sp. nov., isolated from sea sand in Korea...183
• 6) Arenimonas donghaensis gen. nov. sp. nov., isolated from seashore sand...185
• 제 4 장 목표 달성도 및 관련분야에의 기여도...188
• 제1절 연구개발 목표 달성도...188
• 제2절 관련분야 기술발전에의 기여도...189
• 1. 기술적 측면...189
• 2. 경제 . 산업적 측면...189
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...190
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...192
• 제 7 장 참고문헌...193