초록 ▼

본 연구는 배추의 개화시기조절에 관여하는 유전자들을 분리하여 발현 분석을 하고 이 유전자들의 과발현 또는 발현억제 기법을 이용하여 배추 상품성 등에 문제가 되는 저온 추대성을 방지하고 개화시기가 변형된 배추를 개발하는데 목적이 있으며 본 과제의 연구내용 및 범위는 다음과 같다.
1. 개화시기조절 관련 유전자 분리 및 발현 분석
가. 배추 FLC (FLOWERING LOCUS C) 유전자 분리
배추에서 FLC 유전자가 4-5 copy로 존재하는 것을 Southern 분석으로 확인하였다. FLC 유전자를 Brassica

본 연구는 배추의 개화시기조절에 관여하는 유전자들을 분리하여 발현 분석을 하고 이 유전자들의 과발현 또는 발현억제 기법을 이용하여 배추 상품성 등에 문제가 되는 저온 추대성을 방지하고 개화시기가 변형된 배추를 개발하는데 목적이 있으며 본 과제의 연구내용 및 범위는 다음과 같다.
1. 개화시기조절 관련 유전자 분리 및 발현 분석
가. 배추 FLC (FLOWERING LOCUS C) 유전자 분리
배추에서 FLC 유전자가 4-5 copy로 존재하는 것을 Southern 분석으로 확인하였다. FLC 유전자를 Brassica rapa L. ssp pekinensis (Chinese cabbage) inbred line Chiifu에서 제작한 HindIII BAC 클론의 염기서열 (NCBI accession number AC155344, AC155341, AC155342)을 이용하여 서로 다른 FLC 유전자 특이 primer를 작성하였다. 배추 품종 지부로부터 RT-PCR을 이용하여 BrFLC 1 (621bp), BrFLC 2 (591bp), BrFLC 3 (594bp)) 유전자를 분리하여 유전자 등록을 하였다 (BrFLC1 DQ866874, BrFLC2 DQ866875, BrFLC3 DQ866876). 애기장대 FLC와 BrFLC 1, BrFLC 2, BrFLC 3의 MADS domain 부분은 96-100%의 상동성을 나타내었으며 MADS domain 외의 부분은 상동성이 77-83%였다.
나. 개화시기가 다른 배추품종 및 저온 처리 기간에 따른 FLC 유전자 발현 분석 개화시기가 빠른 조추대 (HN3B), 중간인 중추대 (DH01), 개화시기가 늦은 만추대 (DH03) 배추의 품종을 동부한농(주) 육종연구소로부터 분양 받아 저온처리 (4℃) 전 후로 FLC와 AGL20 (AGAMOUS-LIKE 20) 유전자의 발현 양상을 조사하였다. FLC 유전자는 저온처리 전에는 발현양이 많다가 저온처리 기간이 길어짐에 따라 (10일, 40일) 현저히 감소하였다. 저온처리 10일, 40일에서 FLC 발현양은 조추대에서 보다 만추대에서 많았으며 저온처리 40일 후 상온 (24±1 ℃)에서 30일 성장한 경우에는 조추대, 중추대, 만추대 배추 모두에서 FLC 발현이 거의 나타나지 않았다. 개화촉진과 관련된 AGL20 유전자 발현은 저온처리 40일 후에 높았으며 조추대에서 중추대나 만추대보다 발현양이 높았다.
다. 배추에서 BrFLC 1, BrFLC 2, BrFLC 3 유전자의 발현 분석
1) BrFLC 1, BrFLC 2, BrFLC 3 유전자의 PCR 산물의 크기가 다르도록 특이 primer를 작성하여 RT-PCR을 하였다.
2) 여러 배추 품종에서 저온처리를 하지 않은 경우와 저온처리를 10일, 40일 했을 때 모두 BrFLC 1과 BrFLC 2가 BrFLC 3보다 발현양이 높았으며 40일 저온처리에서 BrFLC 3 유전자는 발현이 거의 되지 않았다.
3) 개화시기가 다른 배추 품종에서 BrFLC1, BrFLC 2와 BrFLC 3 유전자 발현양은 조추대에서 중추대와 만추대 보다 낮게 나타났다. 40일 동안의 vernalization 후에는 BrFLC1, 2, 3 모두의 발현양은 중추대, 만추대에서도 낮아졌으며 조추대에서는 거의 발현이 되지 않은 것을 알 수 있었다
4) 배추 잎과 정단부위 조직에서 BrFLC 1과 BrFLC 2 유전자가 BrFLC 3보다 발현양이 높았으며 뿌리에서는 BrFLC 3 유전자 발현이 거의 되지 않았다.
라. 배추 CO, VRN1 유전자 분리 및 발현 분석
1) 배추에서 BrCO (CONSTANS) 유전자는 4-5 copy, BrVRN1 (VERNALIZATION1) 유전자는 2-3 copy로 존재하는 것을 Southern 분석으로 확인하였다.
2) 분리된 BrCO 유전자는 966bp, BrVRN1 유전자는 990bp였으며 아미노산 서열을 애기장대의 것과 비교하여 본 결과 BrCO 유전자는 75%, BrVRN1은 89%의 상동성을 보였다.
3) 배추를 16시간 명, 8시간 암조건으로 일정하게 배양하고 3시간 간격으로 배추 잎을 채취하여 CO 유전자 발현을 확인하여 본 결과 빛이 들어오는 시점에서 감소하기 시작하고 광조건 하에서는 발현이 되지 않고 있다가 저녁시간이 되면서 발현양이 서서히 증가하여 밤 (24시, 3시)에 발현양이 가장 높았다. 이 결과 CO 유전자는 24시간 주기로 발현양이 다르게 변한다는 것을 알 수 있었다.
4) 만추대 배추에서 BrVRN1 유전자는 저온처리를 하지 않은 상태에서 시간이 경과함에 따라 발현이 증가하였으며 저온처리 시 (5일부터 40일)에도 발현양이 점점 높아졌다. 저온처리 후 상온에서 배양한 후에도 VRN1 유전자 발현은 높게 유지되었다. 이러한 발현은 조추대와 중추대에서도 비슷한 양상을 나타내었다.
2. 개화시기조절 유전자를 포함한 식물 형질전환용 벡터 제작 및 형질전환
가. BrFLC 유전자 과발현을 위한 식물 형질전환용 벡터 작성
배추로부터 분리한 BrFLC1, BrFLC2, BrFLC3 유전자 각각에 대한 기능 검정을 하기 위하여 식물 형질전환용 벡터를 작성하였다. 애기장대 형질전환체 선발을 용이하게 하기 위하여 형질전환체 선발마커로 제초제저항성 bar 유전자를 갖고 있는 유전자 과발현 벡터인 pB2GW7 (VIB, 벨지움)을 기본벡터로 사용하였다. 35S 프로모터에 BrFLC1, BrFLC2, BrFLC3 유전자가 융합된 pBrFLC1, pBrFLC2, pBrFLC3를 작성하였다. 배추 형질전환을 위해서 형질전환체 선발마커가 하이그로마이신으로 되어있는 pCAMBIA 1302에 삽입하여 확인을 마친 후 각각 pFLC 1, pFLC 2 및 pFLC 3로 명명하였다.
나. 유전자 발현 억제를 위한 BrCO RNAi, BrVRN1 RNAi 벡터 작성
BrVRN1과 BrCO유전자를 RNAi vector인 pHANNIBAL vector에 cloning하고 이를 다시 hygromycin을 selection marker로 하는 pCAMBIA 1300에 삽입하였으며 최종 확인된 RNAi vector를 각각 pCHV(BrVRN1 유전자)와 pCHC(BrCO 유전자)로 각각 명명하였다.
다. 형질전환체 생산
배추 BrFLC1, BrFLC2, BrFLC3 유전자 기능 검정을 위하여 작성된 애기장대 형질전환용 벡터 pBrFLC1, pBrFLC2, pBrFLC3을 각각 Agrobacterium tumefaciens strain GV3101에 도입한 후 애기장대 꽃에 Agrobacterium을 spray하여 애기장대를 형질전환하였다. 형질전환에 사용된 애기장대 ecotype으로는 FLC 유전자 발현량이 낮은 Columbia type과 FLC 유전자발현이 존재하지 않는 Lansberg erecta, FRIflc mutant를 사용하였다.
배추 형질전환은 FLC 과발현 벡터 pFLC 1, pFLC 2, pFLC 3와 BrCO, BrVRN1 RNAi 벡터 pCHC와 pCHV 벡터를 Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404에 도입한 후 배추 종자로부터 5-6일 발아한 배축을 사용하였다. 형질전환에 사용된 배추 품종으로는 삼진, 권심, inbred line DA001 (동부한농)을 이용하였다. 또한 두 유전자를 동시에 도입하기 위하여 BrFLC 과발현 벡터가 있는 아그로박테리움과 BrCO RNAi, BrVRN1 RNAi 벡터 포함 아그로박테리움을 동시에 배추에 형질전환시키는 co-transformation을 하였다.
3. 개화시기조절 유전자가 도입된 형질전환체 분석
가. BrFLC1, BrFLC2, BrFLC3 유전자가 과발현된 애기장대 형질전환체 분석
애기장대 형질전환체는 제초제 처리로 선발하였으며 게놈으로의 유전자 도입은 Southern 분석으로 확인하였다. 도입된 FLC 유전자는 형질전환체로부터 분리된 RNA로 northern 분석을 하여 발현 확인을 하였다. 비형질전환체 애기장대 식물체에서 Columbia는 엽수가 8-12장, Landsberg는 7-8장, FRIflc mutant는 8-12장 일 때 꽃눈이 보였다. BrFLC1, BrFLC2, BrFLC3 모두 개화시기를 늦추는 효과를 보였으나 BrFLC2와 BrFLC3가 BrFLC1보다 개화지연 특성을 더 나타내었다. 형질전환체들 중에서 개화시기가 지연된 형질전환체 비율은 BrFLC1은 31%, BrFLC2는 32-50%, BrFLC3는 38-73% 정도로 분석되었다.
나. BrFLC1, BrFLC2, BrFLC3 유전자가 과발현된 배추 형질전환체 분석 애기장대에서 개화지연 효과가 가장 있는 것으로 확인된 BrFLC3 유전자를 우선 비교적 형질전환이 잘 되면서 개화시기가 서로 다른 권심과 삼진 배추에 형질전환하였다. 모든 형질전환체 유전자 도입을 Southern 분석으로 확인하였으며 T1에서 개화시기를 분석한 결과 권심에서 개화시기가 비형질전환체 보다 1일 - 36일 정도 늦어졌다. 삼진 배추의 경우 개화에 필요한 저온처리 기간은 권심보다 길으며 20일동안의 vermalization 후 24일 - 32일 되어서 추대가 된다. BrFLC3 유전자가 도입된 T1 세대 삼진배추를 20일 저온처리 후 추대가 될 때까지 소요되는 시간을 조사한 결과 비형질전환체 삼진 배추보다 개화시기가 3일 - 40일 늦어진 것을 알 수 있었다. 보다 빠른 배추 품종 육성을 위해서는 배추의 inbred line에 유전자를 도입하는 것이 최선으로 본 연구에서는 inbred line에 유전자를 도입하였다. FLC 과발현 유전자가 도입된 inbred line 형질전환체 68개체를 획득하였고 이 중 31개체에서 개화지연 효과가 있었다.
다. BrCO RNAi, BrCOVRN1 RNAi 벡터가 도입된 배추 형질전환체 분석
CO 유전자가 가장 많이 발현되는 밤(24시) 시간이 유전자 발현이 감소된 형질전환체에서 개화가 지연되는 것이 관찰되었다. 저온처리 20일 후 VRN1 유전자 발현양이 감소된 개체에서는 FLC 발현이 되었으며 AGL20 발현은 상대적으로 감소하였다. 이러한 유전자 발현양을 나타내는 개체에서 개화지연 효과가 있었다.
라. FLC 과발현 벡터와 BrCO RNAi, BrVRN1 RNAi 벡터가 도입된 배추 형질전환체 분석
두 유전자가 동시에 도입된 inbred line 배추 형질전환체에서 개화가 지연되는 개체가 각각 10개체 이상 있었으며 대체로 두 유전자가 복합적으로 도입된 배추 형질전환체에서 개화가 지연되는 효과가 높은 것으로 관찰되었다.

Abstract ▼

The timing of the transition from vegetative to reproductive development in plant is regulated by a combination of endogenous (hormone) and environmental factors (photoperiod and temperature). Low temperature treatment (vernalization) is required to induce flowering in Chinese cabbage (Brassica rapa

The timing of the transition from vegetative to reproductive development in plant is regulated by a combination of endogenous (hormone) and environmental factors (photoperiod and temperature). Low temperature treatment (vernalization) is required to induce flowering in Chinese cabbage (Brassica rapa L. ssp pekinensis). FLC (FLOWERING LOCUS C) gene encoding a MADS box transcription factor plays an important role in control of flowering time as a floral repressor. The studies on the control of flowering time in Chinese cabbage are very important to understand flowering mechanisms and produce high yields of vegetative tissues. Exposure to cold temperature, known as vernalization and long day condition promotes flowering time of Chinese cabbage.
Chinese cabbage plants remain in the vegetative growth phase until they have experienced prolonged exposure to cold temperature, known as vernalization. This inhibition to flowering is due to high level of FLOWERING LOCUS C (FLC) expression. In order to increase product value of Chinese cabbage by inhibiting floral transition, three genes (BrFLC1, BrFLC2, and BrFLC3) homologues to AtFLC genes, a floral repressor, were isolated from Chinese cabbage Chiifu. These genes showed high similarity to AtFLC, except that putative BrFLC1 protein contained ten more residues than did AtFLC. These BrFLC genes were ubiquitously expressed, except that BrFLC3 expression was not detected in roots. BrFLC1 and BrFLC2 showed stronger expression than did BrFLC3 in unvernalized and vernalized Chinese cabbage plants. Expression levels of three BrFLC genes were lower in an early flowering of cultivar of Chinese cabbage plants, suggesting that BrFLC level is associated with flowering time of Chinese cabbage plants. In order to examine the expression of each BrFLC gene, upstream region (-2kb) was introduced into Arabidopsis, and GUS and gfp expression was observed in tissues. Constitutive expression of BrFLC genes significantly delayed flowering in Arabidopsis. Delay in flowering was also observed in transgenic Chinese cabbage plants overexpressing BrFLC3. These results suggested that BrFLC genes act similarly as does AtFLC.

목차 Contents

• 제출문 ...1
• 요약문 ...2
• SUMMARY ...10
• CONTENTS ...12
• 목차 ...14
• 제1장 연구개발과제의 개요 ...17
• 1. 연구개발의 목적 및 필요성 ...17
• 가. 기술적 측면 ...18
• 나. 경제.산업적 측면 ...18
• 다. 사회.문화적 측면 ...19
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ...20
• 1. 국외 관련 기술개발 현황 ...20
• 2. 국내 관련 기술개발 현황 ...22
• 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ...23
• 1. 연구개발 수행 방법 ...23
• 가. 개화시기 조절 관련 유전자 분리 및 분석 ...23
• 1) 배추에서 개화시기 조절 유전자 copy 수 확인 ...23
• 2) 배추로부터 BrFLC, BrCO, BrVRN1 유전자 분리 ...23
• 3) 분리된 유전자의 상동성 분석 ...24
• 나. 배추에서 개화시기 조절 유전자 발현 분석 ...24
• 다. 개화시기 조절 유전자 식물 형질전환용 벡터 작성 ...24
• 1) FLC 과발현 벡터 작성 ...24
• 가) 애기장대 형질전환용 벡터 작성 ...24
• 나) 배추 형질전환용 벡터 작성 ...25
• 2) BrCO RNAi, BrVRN1 RNAi 벡터 작성 ...26
• 가) BrCO 유전자를 포함하는 RNAi 벡터 제작 ...26
• 나) BrVRN1 유전자를 포함하는 RNAi 벡터 제작 ...27
• 라. 작성된 벡터의 아그로박테리움으로의 형질전환 ...27
• 마. 식물 형질전환 ...28
• 1) 애기장대 형질전환 ...28
• 2) 배추 형질전환 ...28
• 바. 형질전환체에서 유전자 도입 및 발현 분석 ...29
• 1) 유전자 도입 확인 ...29
• 2) 유전자 발현 확인 ...30
• 사. 형질전환체에서 개화시기 분석 ...30
• 1) 애기장대 형질전환체에서 개화시기 분석 ...30
• 2) 배추 형질전환체에서 개화시기 분석 ...31
• 2. 연구수행 내용 및 결과 ...32
• 가. 배추 개화시기조절 관련 유전자 분리 및 분석 ...32
• 1) 배추 FLC (BrFLC) 유전자 분리 및 발현 분석 ...32
• 가) 배추 BrFLC 유전자 분리 ...32
• 나) 배추에서 BrFLC 유전자 발현 분석 ...36
• (1) 배추 BrFLC의 조직 특이 발현 ...36
• (2) 개화시기가 다른 배추 품종에서 BrFLC 발현 분석 ...37
• (3) Vernalization 기간에 따른 BrFLC 발현 분석 ...37
• (4) 배추 BrFLC1, BrFLC2, BrFLC3 유전자 프로모터 분석 ...39
• 2) 배추 BrCO 유전자 분리 및 발현 분석 ...45
• 3) 배추 BrVRN1 유전자 분리 및 발현 분석 ...49
• 나. 개화시기조절 유전자의 식물형질전환용 벡터 작성 ...53
• 1) BrFLC 유전자 과발현 벡터 작성 ...53
• 가) 애기장대 형질전환용 벡터 작성 ...53
• 나) 배추 형질전환용 벡터 작성 ...53
• 2) BrCO RNAi, BrVRN1 RNAi 벡터작성 ...55
• 다. 개화시기조절 유전자가 도입된 형질전환체 생산 및 분석 ...60
• 1) BrFLC 과발현 형질전환체 생산 및 분석 ...60
• 가) 애기장대 형질전환체 생산 및 분석 ...60
• 나) 배추 형질전환체 생산 및 분석 ...63
• (1) BrFLC 유전자 과발현 배추 형질전환체 생산 및 유전자 도입 확인 ...63
• (2) 배추 형질전환체 개화시기 분석 ...65
• 2) BrCO RNAi 벡터를 이용한 배추 형질전환체 생산 및 분석 ...70
• 3) BrVRN1 RNAi 벡터를 이용한 배추 형질전환체 생산 및 분석 ...72
• 4) BrFLC 과발현과 BrCO RNAi 벡터를 이용한 배추 형질전환체 생산 및 분석 ...74
• 5) BrFLC 과발현과 BrVRN1 RNAi 벡터를 이용한 배추 형질전환체 생산 및 분석 ...77
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...78
• 1. 연구 목표달성도 ...78
• 2. 관련 분야에의 기여도 ...82
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ...84
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ...86
• 제7장 참고문헌 ...87