초록 ▼

1. 환경오염 정화 수목의 선발과 균근균을 이용한 오염물질의 정화능력 향상 본 연구는 목본식물 중 포플러 속에서의 중금속 내성 및 흡수능이 우수한 수종선발하고, 목본식물과 공생을 하고있는 균근균을 접종하여 중금속에 대한 흡수능력
을 향상시키고자 하였다. 또한 균근균이 접종된 묘목을 오염지에 이식하여 현지의 적응력을 검토하며 식물체내 중금속 축적 기작을 밝히고자 다음과 같이 추진하였다.
가. 오염지 현황 및 특성 파악
본 연구의 대상지 선정을 하고 특성을 파악하기 위하여 오염지의 토양 특성을 측정하였다. 조사대상지는

1. 환경오염 정화 수목의 선발과 균근균을 이용한 오염물질의 정화능력 향상 본 연구는 목본식물 중 포플러 속에서의 중금속 내성 및 흡수능이 우수한 수종선발하고, 목본식물과 공생을 하고있는 균근균을 접종하여 중금속에 대한 흡수능력
을 향상시키고자 하였다. 또한 균근균이 접종된 묘목을 오염지에 이식하여 현지의 적응력을 검토하며 식물체내 중금속 축적 기작을 밝히고자 다음과 같이 추진하였다.
가. 오염지 현황 및 특성 파악
본 연구의 대상지 선정을 하고 특성을 파악하기 위하여 오염지의 토양 특성을 측정하였다. 조사대상지는 폐광지를 중심으로 조사하였으며, 오염원을 중심으로 거리에 따른 오염도 추이를 측정하기 위하여 깊이별(1~15cm, 15~30cm)로 토양 시료를 채취하였다. 채취된 토양 시료는 pH , 양이온치환능력, 각종 중금속 함량 등을 측정하여 내성 수종을 선발하기 위한 설계 기준으로 이용하였다.
나, 균근균의 중금속에 대한 내성 평가 및 내성 균종의 선발
공시 균주는 Pisolithus tinctorius , Laccaria laccata, Suillus bovinus 및 Suillus luteus의 4종을 이용하였으며, 중금속(Zn, Cu, Pb)이 처리된 배지 위에서 52일간 배양하였다. 각 균근균이 배양되는 동안, 일정한 간격으로 생장속도를 측정하였으며, 생장이 종료된 후, 균사를 분리하여 균사내 중금속 농도를 측정하였다. 측정결과는 각 균근균의 중금속에 대한 내성 평가와 내성 균근균을 선발하는데 이용하였다.
다. 포플러 속의 내성 수종 선발 및 내성 특성 분석
생장속도가 빠르고, 근계 발달이 왕성한 포플러 속 중 현사시나무(Populus alba $\times$gandulosa), 수원포플러(Populus koreana $\times$ nigra var. italica.), 양황철나무 (Populus nigra $\times$ maximowiczii), 이태리포플러(Populus euramericana)를 각각 무처리구, 중금속(Cd, Pb)처리구로 구분하여 식재하였다. 중금속 처리는 오염지의 중금속 함량을 고려하여 시용량을 달리하여 처리한 후 식재 하여, 각 수종의 생리적인 특성을 조사하였으며, 수확 후 생체량 및 체내 중금속농도를 측정하여, 수종별 내성 특성을 분석하였다.
라. 오염지에서의 생장특성 및 적응력
선발된 수종은 인위적으로 처리된 오염지에 식재하였으며, 생장이 완전히 끝난후 줄기를 수확하였다. 수확된 줄기는 건조 후에 각 수종별로 생체량이 측정되었으며, 측정 결과를 이용하여 중금속에 대한 반응과 균근균에 대한 생장반응을 비교하
였다.
2. 중금속 결합 단백질 유전자 도입에 의한 토양 중금속 제거 수목의 육종
가. Metallothionein 및 Ferritin유전자의 클로닝
본 연구에서는 유전자 염기서열이 밝혀진 rat (Rattus norvegicus )의 class - Imetallothionein 유전자의 염기서열을 바탕으로 computer program을 이용하여 PCR의 primer로 사용될 수 있는 $5^{\prime}$ primer ($5^{\prime}$ - TCg TCA CTT CAg gCA CAg CA- $3^{\prime}$ ), $3^{\prime}$ primer ($5^{\prime}$ - TCG TCA CTT CAG GCA CAG CA- $3^{\prime}$ )를 합성하여 PCR을 실시하여 유전자를 클로닝하였다. Ferritin유전자의 클로닝은 이미 알려진 ferritin유전자 H - chain과 L - chain의 염기서열로부터 $5^{\prime}$ primer(H - chani $5^{\prime}$ - Agg CCC CCg CCg CCg CTC CAg CCA - $3^{\prime}$ ; L - chain $5^{\prime}$ - gAT CCg ggg ACT CTC TTC - $3^{\prime}$ )과 $3^{\prime}$primer (H - chain $5^{\prime}$ - ggT ACC AAA TTT CTT TAT TTg - $3^{\prime}$ ; L- chain $5^{\prime}$ - ggg CCC TTC AgA AgT CgC Tgg - $3^{\prime}$ )의 primer를 합성하고, 인간의 심장과 간 세포배양액에 Fe를 처리하여 ferritin유전자 발현을 유도하여 분리한 mRNA로부터 reverse transcriptase를 사용하여 firststrand cDNA를 합성 한 후 RT - PCR을 행하여 ferritin유전자를 클로닝하였다.
나. Metallothionein 및 Ferritin유전자의 특성화
유전자의 특성화를 위해 cloning한 유전자의 염기서열을 dideoxynucleotide chain termination 방법으로 결정하였다. 염기서열 결정의 효율을 높이기 위해 획득한 clone을 unidirectional deletion 방법으로 처리하여 적절한 크기의 단축 clone들을 획득, sequencing에 사용하였다.
다. Metallothionein 및 Ferritin유전자의 식물체내 도입을 위한 재조합 유전자의제조
특성화된 Metallothionein 및 Ferritin유전자를 식물로의 도입 및 발현시키기 위해 식물발현용 유전자 운반체와 재조합하였다. 식물 유전자 운반체로는 Agrobacterium 의 Ti- plasmid에서 유도된 운반체를 사용하였다. 도입 유전자의 발현을 결정하는 $5^{\prime}$ - 조절인자는 식물 virus인 cauliflower mosaic virus (CaMV)에서 유도된 항시성promoter인 35S promoter와 이것에 enhancer부위를 부착한 duplicate 35S promoter 를 사용하였다. 또 이 재조합 운반체는 형질전환 세포의 선발을 위해 bacteria의 neomycin phosphotrans ferase II (NPT II)를 함유하고 있어 항생물질에 의해 형질전환 세포를 선발하였다.
라. 포플러의 형질전환 및 재분화
수원포플러를 공시재료로 하여 성숙목의 가지를 채취하여 온실에서 눈을 띄워 액아를 유도한 후 액아 절편체를 잘라서 MS배지에 치상하였고, 매 4주마다 계대배양하였다. 기내에서 생장중인 엽병과 절간조직을 형질전환 재료로 이용하였다. 재조합유전자를 포함하는 A . tumefaciens 균주를 접종한 후 캘러스 형성이 용이하도록 메스로 잘게 상처를 준다. 준비된 엽병 및 절간조직 절편체를 LB배지에서 overnight 배양하여 키운 A. tumefaciens LBA4404와 함께 co- culture한 후 멸균된 여과지에 놓아 과잉의 박테리아 액을 닦아내고, MS 배지에 암소 배양하였다. 공조 배양 후, 절편체를 캘러스 유도배지에서 2주간 암배양을 하였다. 그후 재분화배지에 2주마다 계대배양하였다. 캘러스로부터 재 분화된 줄기는 발근 배지에서 뿌리를 형성시킨 후, 온실에서 폿트묘로 육성하였다.
마. 재분화 포플러의 분석
Antibiotics 에 내성을 가지는 재분화 포플러에서 얻은 DNA를 여러 제한효소로 자른 절편과 도입유전자 특이적 부분을 방사성 동위원소로 표지한 probe간의 DNA- DNA hybridization을 이용한 Southern- blot analysis를 실시하여 도입된 유전자의 안정성을 결정하고 나아가 식물 염색체에 얼마나 많은 copy로 존재하는가를 결정하였다. 또한 도입유전자의 발현량을 확인하기 위하여 식물 조직에서 mRNA를 분리한 후 재조합 유전자가 전사되는가를 Northern- blot analysis를 통해 확인하였다.
바. in vitro에서의 형질전환 식물체내 중금속 축적의 분석
선발되어진 형질전환체의 중금속 정화능력을 조사하기 위하여 농도별 각종의 중금속을 포함하는 배지에서 생육을 시킨 후 세포 내에 축적되어진 중금속의 양을 측정하고 정화능력이 뛰어난 개체를 선발하였다. 중금속의 분석은 원자흡광도계를 이
용하여 측정하였다.
사. 오염지역에의 적용시험 및 중금속 축적의 분석
선발되어진 중금속 정화능력이 우수한 형질전환체를 순화시킨 후에 개체의 증식을 하고 이를 실제 오염지역에 재배하여 각 개체의 중금속 정화능력을 조사한다. 중금속의 분석은 원자흡광도계를 이용하여 측정하였다.
3. NO2 동화경로 관여 유전자 도입에 의한 대기오염 정화 포플러의 육종 본 연구에서는 NO2 동화경로의 관여 효소 중 NiR 유전자의 발현수준을 인위적으로 조절할 수 있도록 재조합 되어진 유전자를 포플러에 도입, 발현시켜 대기오염물
질을 정화시킬 수 있는 식물을 육성하고자 한다. 위와 같은 목적을 달성하기 위하여 사용하는 방법은 아래와 같다.
가. NiR 유전자의 cloning
본 연구에서는 암상태에서 키운 Spinacia oleracea의 잎으로부터 RNA를 분리한 후 이미 알려진 cDNA의 염기배열을 기본으로 하여 computer program을 이용 transcription initiation site를 포함하는 $5^{\prime}$ primer($5^{\prime}$ - GGA ATT CCA TCA GAT TAA CAT AAT TTC ACA AT - $3^{\prime}$ )와 polyadenylation signal을 포함하는 $3^{\prime}$ primer($5^{\prime}$ - GTA ATA TAA TTC TAA CAA TTA- $3^{\prime}$ )를 디자인하고 reverse transcriptase를 이용한 RT - PCR을 실시한다. PCR반응에 의해 특이적으로 증폭된 DNA를 agarose gel에서 분리 획득하여 kinase와 klenow enzyme을 처리한 후plasmid vector(pUC18)에 blunt- end ligation을 하여 cloning하였다.
나. 유전자의 특성화
유전자의 특성화를 위해 cloning한 유전자의 염기서열을 dideoxynucleotide chain termination 방법으로 결정하였다. 염기서열 결정의 효율을 높이기 위해 획득한 clone을 unidirectional deletion 방법으로 처리하여 적절한 크기의 단축 clone들을 획득, sequencing에 사용하였다. 확인된 NiR cDNA를 식물에서 발현할 수 있도록 재조합을 하였다.
다. NiR 유전자의 식물체내의 도입을 위한 재조합 유전자 제조
특성화된 Spinacia oleracea의 NiR 유전자를 식물로의 도입 및 발현시키기 위해 식물발현용 유전자 운반체와 재조합하였다. 식물 유전자 운반체로는 Agrobacterium 의 Ti- plasmid에서 유도된 운반체를 사용하였다. 도입 유전자의 발현을 결정하는 $5^{\prime}$ - 조절인자는 식물 virus인 cauliflower mosaic virus (CaMV)에서 유도된 항시성promoter인 35S promoter와 이것에 enhancer부위를 부착한 duplicate 35S promoter 를 사용하였다. 또 이 재조합 운반체는 형질전환 세포의 선발을 위해 bacteria의 neomycin phosphotrans ferase II (NPT II)를 함유하고 있어 항생물질에 의해 형질전환 세포를 선발하였다.
라. 포플러의 형질전환 및 재분화
수원포플러를 공시재료로 하여 성숙목의 가지를 채취하여 온실에서 눈을 띄워 액아를 유도한 후 액아절편체를 잘라서 MS배지에 치상하고, 매 4주마다 계대배양하였다. 기내에서 생장중인 엽병과 절간조직을 형질전환 재료로 이용하였다. 재조합 유전자를 포함하는 A . tumefaciens 균주를 접종한 후 캘러스 형성이 용이하도록 메스로 잘게 상처를 주었다. 준비된 엽병 및 절간조직 절편체를 LB배지에서 overnight 배양하여 키운 A. tumefaciens LBA4404과 함께 co- culture한 후 멸균된 여과지에 놓아과잉의 박테리아 액을 닦아내고, MS 배지에 암소 배양하였다. 공조배양 후, 절편체를 캘러스 유도배지에서 2주간 암배양 하였다. 그 후 재분화배지에 2주마다 계대배양하였다. 캘러스로 부터 재 분화된 줄기는 발근 배지에서 뿌리를 형성시킨 후, 온실에서 폿트묘로 육성하였다.
마. 재분화 포플러의 분석
Antibiotics 에 내성을 가지는 재분화 포플러에서 얻은 DNA를 여러 제한효소로 자른 절편과 도입유전자의 특이적 부분을 방사성 동위원소로 표지한 probe간의 DNA- DNA hybridization을 이용한 Southern- blot analysis를 실시하여 도입된 유전자의 안정성을 결정하고 나아가 식물 염색체에 얼마나 많은 copy로 존재하는가를 결정하였다. 또한 도입유전자의 발현량을 확인하기 위하여 식물 조직에서 mRNA를 분리한 후 재조합 유전자가 전사되는가를 Northern- blot analysis를 통해 확인하였다.
바. 형질전환 식물체의 NO2에 대한 저항성 조사
선발되어진 형질전환체의 NO2의 정화능력을 조사하기 위하여 NO2를 농도별로 처리한 생장상에서 생육을 시킨 후, kjeldahl 분해장치를 이용하여 세포내의 질소량을 측정하고 정화능력이 뛰어난 개체를 선발한다. 선발되어진 NO2 정화능력이 우수한 형질전환체를 순화시킨 후에 개체의 증식을 하고 이를 실제 오염지역에 재배하여각 개체의 대기오염 정화능력을 조사하였다

Abstract ▼

Part I. Development of plants with high decontaminating ability using mycorrhizal fungi.
Soils and leaves, stems, and roots of tree species were collected from closed mine sites. Metal concentration in tissue and soil was analyzed, the realtion to plant and soil was identified. Four mycorrhizal f

Part I. Development of plants with high decontaminating ability using mycorrhizal fungi.
Soils and leaves, stems, and roots of tree species were collected from closed mine sites. Metal concentration in tissue and soil was analyzed, the realtion to plant and soil was identified. Four mycorrhizal fungi(Pisolithus tinctorius, Laccaria laccata), Suillus bovinus, and Suillus luteus) were incubated on medium treated with heavy metals (Zn, Pb, and Cu) for 52 days. Their metal tolerance
was tested through measuring the fungal growth and the metal concentration in fungal mycelia. Four Populus species were inoculated with mycorrhiza(P isolithus tinctorius ), and were treated with Cd(0, 30ppm and 80ppm) and Pb(0, 50ppm and 300ppm) in soil. Physiological characters of poplars were measured for the growing season, and their heavy metal tolerance and metal uptake ability were
analyzed at the end of the growing season,
Part II. Dev elopment of transgenic poplars carrying heavy metal binding protein genes for cleaning of polluted soil This work basically aims at the development of transgenic poplars that could withstand heavy metal stress. Since no such systems were available at the beginning, this project dealt with all the steps to develop a phytoremediation system ranging from cloning the genes to tolerance test of trans genic poplars. These are i) cloning of the MT and ferritin gene by RT - PCR, ii) construction of plant expression vectors using the genes, iii) transformation of poplar using the vectors, iv) regeneration and propagation of transgenic poplars for tolerance test, v) confirmation of both trans formation and gene expression by PCR and RT - PCR, and vi) tolerance test using in vitro as says as well as by various biochemical methods.
Part III. Development of Air- Pollutant- Philic Plants by trans formation of nitrite reductase
Nitrite reductase (NiR) is a key enzyme. NiR gene (3.0 Kb) from Spinacia olerace a was amplified by PCR and full lengths equence was identified. The constructed vector which contains NiR gene of Spinacia oleracea was fused to the duplicated CaMV 35S promoter. The plasmid was introduced into tobacco and poplar plants using A. tumefaciens harboring NiR gene.

목차 Contents

• 표지...1
• 최종보고서...2
• 제출문...3
• 요약문...4
• SUMMARY...15
• CONTENTS...21
• 목차...23
• 서론...25
• 제1장 환경오염 정화수목의 선발과 균근균을 이용한 오염물질 정화능력 향상...28
• 제1절 서설...29
• 제2절 재료 및 방법...31
• 제3절 결과 및 고찰...36
• 제4절 결 론...76
• 인용문헌...78
• 제2장 중금속 결합 단백질 유전자 도입에 의한 토양 중금속 제거 수목의 육성...84
• 제1절 서설...85
• 제2절 재료 및 방법...88
• 제3절 결과 및 고찰...92
• 제4절 결론...107
• 참고문헌...110
• 제3장 NO2 동화경로 관여 유전자 도입에 의한 대기오염 정화 포플러의 육종...114
• 제1절 서설...115
• 제2절 재료 및 방법...117
• 제3절 결과 및 고찰...121
• 제4절 요약 및 결론...141
• 인용문헌...142