초록 ▼

1. Lactic acid dehydrogenase 생산성이 높은 미생물 배양물 개발에 관한 연구
가. Lactic acid dehydrogenase 생성 미생물의 확보
Lactate의 이용성이 높은 균주를 분리하기 위하여 시료를 채취한 후 멸균식염수로 현탁시키고 각각의 선택배지(DHL, TATAC, PEES, YM, LBS, BS, NBGT 등)에 도말한 후 370C에서 배양하여 나타난 colon y를 분리하였다. 고활력 균주의 선발은 분리한 미생물중 lactate 첨가 배지에서의 성장율이 우수한 균주를 선별하기 위하여

1. Lactic acid dehydrogenase 생산성이 높은 미생물 배양물 개발에 관한 연구
가. Lactic acid dehydrogenase 생성 미생물의 확보
Lactate의 이용성이 높은 균주를 분리하기 위하여 시료를 채취한 후 멸균식염수로 현탁시키고 각각의 선택배지(DHL, TATAC, PEES, YM, LBS, BS, NBGT 등)에 도말한 후 370C에서 배양하여 나타난 colon y를 분리하였다. 고활력 균주의 선발은 분리한 미생물중 lactate 첨가 배지에서의 성장율이 우수한 균주를 선별하기 위하여, 분리한 400여종의 미생물을 탄소원을 lactate로 제한한 MRS Broth에 접종하고 집적배양을 실시하여 우세하게 성장하는 10여종의 미생물을 분리하여 선발과정에서 이용하였다. 또한 본 연구목표 달성 가능성이 높은 균주를 위주로 당발효 검사와 생화학적 검사 및 Microbial Id entification(MIDI) 등을 통하여 미생물을 간이 동정하였다.
나. Lactic acid dehydrogenase 생성 미생물 배양조건 확립
선별한 미생물의 증식을 위한 최적 pH 범위, 최적 온도범위를 조사한 후 최적 생육조건을 결정하기 위하여 탄소, 질소, 인과 칼륨, 무기염류, 비타민 요구수준 및 C/ N 비율을 조사한다. 선별한 효모의 산업적 배양을 위한 적정기질을 조사하기 위하여 산업적으로 이용가능한 lactate 등을 포함한 탄소원, 요소 등을 포함한 질소원, KH2PO4 등을 포함한 인과 칼륨, 무기염류의 종류와 첨가수준실험을 실시한다.
다. Lactic acid dehydrogenase 생산 균주의 생산성 및 안정성 구명
선별한 미생물을 이용한 lactic acid d ehyd rogen ase 생산물의 반추위내 발효특성에 미치는 효과 및 적정 사용수준을 조사하기 위하여 반추위에 Can nu lae가 장착된 산양(in vivo)과 인공반추위(in vitro)를 이용하여 pH, lactate, VFA 등의 발효생성물변화를 조사하고 in situ nylon bag 방법을 이용하여 사료의 반추위내 분해율 및 이용율 등을 조사한다.
2. 도축 반추위내용물을 이용한 효모 및 곰팡이 배양물 개발에 관한 연구
가. 도축 반추위내용물 이용 미생물의 확보
반추위 내용물의 이용성이 높은 균주를 분리하기 위하여 도축장의 폐수, 토양 및 폐기물 등에서 분리용 시료를 채취한 후 멸균식염수로 현탁시키고 살균한 반추위액에 1%(vol/ vol) 접종한 후 진탕배양기에서 3일간 배양하고 배양액을 희석하여
YM agar 평판배지에 p ou ring한 후 배양하면서 우세하게 나타나는 colony를 3차 계대하여 완전 분리하고 검경을 통해 효모를 선별한다. 그리고 도축 반추위내용물에서 배양하면서 생육도, 효소역가 및 발효 생성물, 내열성 등을 측정하여 유용균주를 선별한 후 동정한다.
나. 분리 미생물의 도축 반추위내용물에서의 배양조건 확립
선별한 효모 및 곰팡이의 증식을 위한 최적 pH 범위, 최적 온도범위를 조사한 후 최적 생육조건을 결정하기 위하여 탄소, 질소, 인과 칼륨, 무기염류, 비타민 요구수준 및 C/ N 비율을 조사한다. 반추위 내용물을 효모 및 곰팡이 배양 기질화 하기
위하여 반추위 내용물을 잘 혼합한 후 압착 추출한 whole rumen extract 등 액상의 처리방법과 사용수준 및 이용성을 조사하고 고형물 당화 등의 처리방법과 사용수준 및 이용성을 조사하고 산업적 배양을 위한 탄소원, 요소 등을 포함한 질소원, KH2PO4등을 포함한 인과 칼륨, 무기염류의 종류와 보충수준실험을 실시한다.
다. 도축 반추위 내용물 이용 균주의 생산성 및 안정성 구명
선별한 효모와 곰팡이의 배양조건을 조사하기 위하여 종균제조 조건 및 발효조 system, 살균, 교반강도, 회전수, 거품유무, 발효열, 퇴적방법 등의 조건과 제어방법을 실험하고 Scale u p 조건을 조사하고 경제성을 분석한다. 또한 도축반추위 내용물을 이용하여 20리터까지 대량 배양하여 배양물이 양계, 양돈 및 축우의 사료 이용율에 미치는 효과를 조사하기 위하여 육계, 산란계, 양돈, 젖소 및 육우 사료에 수준별로 첨가하여 소화율을 조사하고 반추위 내 발효특성에 미치는 효과를 인공반추위(in vitro)를 이용하여 구명한다.
3. Chromosome homologous integration 방법을 통하여 cellulase를 생산하는 새로운 생균제의 개발
섬유소(cellu lose)의 이용은 전통적으로 화학적, 효소적 분해에 비교적 안정한 천연상태의 것을 그대로 직접 펄프, 건축재, 의류, 연료로 이용하였으나, 1970년대초 석유파동을 거치면서 섬유소가 화석자원과는 달리 계속 축적되는 탄소원이라는 점에서 식량과 에너지원으로서 섬유소를 이용하고자 섬유소를 가수분해하여 Single Cell Protein이나 알콜, 아세톤 생산 등의 간접적 이용 및 폐수처리에 이르기 까지 많은 연구가 보고되고 있다.
Cellu lase를 이용한 섬유소의 생물학적 가수분해는 화학적 방법과 비교하여 많은 장점을 지니고 있으나, 반응속도가 늦고 분해율이 극히 낮을 뿐 아니라 효소생산 비용이 매우 높아 섬유소 자원 이용에 큰 저해요인이 되고 있다. 이런 문제점을 보완하기 위해서는 무엇보다도 섬유소 분해 관련 효소를 생산하는 미생물을 개발하고, 보다효과적인 효소 반응조건을 모색하여 높은 분해력을 가진 cellu lase를 경제적으로 대량생산하는 것과 cloning된 cellu lase 유전자를 이용하여 산업적으로 유용한 미생물에 형질전환시켜서 이들 미생물로부터 유용물질의 생산과 미생물 자체의 이용방안을 모색하는 것이 섬유소 자원의 적극적인 이용을 위해 매우 중요한 과제라고 하겠다.
따라서 본 연구의 내용은 다양한 섬유소 분해 미생물들로 부터 분리된 cellu lase 유전자를 bank하여 그들의 효소학적 특성을 규명함과 동시에 clonin g vector를 이용한 유전자재조합 기법을 통해 내산성 장내 미생물인 Lactobacilli에 형질전환시킴으로써 cellu lase 분비능력을 갖는 Lactobacilli의 새로운 미생물 균주를 개발하는 것이다. 또한 이들 미생물로부터 유전자의 발현양상과 안정성 및 생산된 cellu lase 특성을 규명하여 최종적으로 이러한 cellu lase 유전자가 형질전환된 Lactobacilli 균주를 단위동물의 사료에 첨가하여 장관 내에 정착시킴으로써 균주자체가 갖는 생균제로서의 고유한 기능과 아울러 cellu ose를 분해 이용하는 새로운 생균제를 개발함으로써 단위동물에서 파생된 영양학적 문제점을 해결함과 동시에 나아가 고기능성 재조합 장내 미생물의 균주육종과 유용대사산물을 생산하기위한 대량생산체계 방법을 모색하고자 본 연구를 실시하였다.

Abstract ▼

1) For th e screenin g LDH-p rodu cing bacteria, 327 strains were isolated from variou s sou rces, such as foods, water, p lants, soil, feces, byp roducts and wh at n ot. 184 acid -prod u cing strains were selected med ium above 327 isolates by yellow colou rzone forming on selected med ium containi

1) For th e screenin g LDH-p rodu cing bacteria, 327 strains were isolated from variou s sou rces, such as foods, water, p lants, soil, feces, byp roducts and wh at n ot. 184 acid -prod u cing strains were selected med ium above 327 isolates by yellow colou rzone forming on selected med ium containing ind icater (bromocrezol green) an d th en 89 lactate-u tilizing strain s which grew well on th e lactate med ium were selected . 20 strain s wh ich produce LDH were selected finally by LDH-staining method with native PAGE. FFy111-1 amon g LDH-producing strains was fou nd to produce LDH with the most high en zyme activity. The sp ecific activity was revealed 28.68 moles red u ced NAD/ min/ mg p rotein . LDH in cultu re fluid was found by LDH-straining method s with native PAGE. This resu lt in d icated that FFy111-1 p rod u ced extracellu lar LDH. The strain FFy111-1 was ind icated as Lactobacillus sp. and n amed Lactobacillus sp. FFy111-1.
2) LDH activities and cell growth of Lactobacillus sp . FFy111-1 were in creaed by glu cose, fru ctose and maltose as carbon sou rces, yeast extract, NH4Cl, (NH4)2PO4 as nitrogen and NaCl an d KH2PO4 among th e mineral sou rces.

목차 Contents

• 제출문 ...1
• 요약문 ...2
• SUMMARY ...15
• CONTENTS ...22
• 목차 ...30
• 제1장 서 론 ...39
• 제2장 Lactic acid dehydrogenase 생산성이 높은 미생물 배양물 개발에 관한 연구 ...49
• 제1절 Lactate dehydrogenase 생성 균주의 분리 및 동정 ...49
• 1. 서 론 ...49
• 2. 재료 및 방법 ...50
• 가. 시료의 선택 ...50
• 나. 배지 ...50
• 다. LDH 생성 균주의 선별 ...50
• 라. 조효소액의 제조 ...51
• 마. Lactate dehydrogenase 분석 ...51
• 바. Gel 전기영동 ...51
• 사. LDH-생성 균주의 동정 ...52
• 3. 결과 및 고찰 ...52
• 제2절 Lactobacillus sp . FFy111-1의 성장 및 LDH 생성 조건 ...59
• 1. 서 론 ...59
• 2. 재료 및 방법 ...60
• 가. 균주의 선별 ...60
• 나. 배지 ...60
• 다. 성장률의 측정 ...60
• 라. 배양조건의 조절 ...60
• 마. 조효소액의 제조 ...61
• 바. Lactate dehydrogenase 분석 ...61
• 3. 결과 및 고찰 ...61
• 가. 탄소원이 성장 및 효소 활성에 미치는 영향 ...61
• 나. 질소원이 성장과 효소 활성에 미치는 영향 ...66
• 다. 광물질 공급원이 성장 및 효소 활성에 미치는 영향 ...70
• 라. pH, 온도 및 배양시간이 성장 및 효소 활성에 미치는 영향 ...74
• 제3절 Lactobacillus sp . FFy111-1로부터 생성되는 lactate dehydrogenase의 특성 ...78
• 1. 서 론 ...78
• 2. 재료 및 방법 ...79
• 가. 균주의 선별 ...79
• 나. 배양 온도의 결정 ...79
• 다. 배양 pH의 결정 ...79
• 라. L-nLDH 활성에 관한 휘발성 지방산의 효과 ...80
• 마. L-nLDH 활성에 관한 금속이온의 효과 ...80
• 바. 조효소의 준비 ...80
• 사. Lactate dehydrogenase 분석 ...81
• 3. 결과 및 고찰 ...81
• 가. 효소 활성에 미치는 pH의 영향 ...81
• 나. 효소 활성에 미치는 온도의 영향 ...83
• 다. 효소 활성에 미치는 휘발성 지방산의 영향 ...85
• 라. 효소 활성에 미치는 금속이온의 영향 ...87
• 제4절 Lactate dehydrogenase의 공급이 in vitro 상에서 lactic acid 축적에 미치는 영향 ...88
• 1. 서 론 ...88
• 2. 재료 및 방법 ...89
• 가. Direct-fed microbials의 준비 ...89
• 나. 조효소액의 제조 ...89
• 다. In vitro 상에서 발효의 준비 ...90
• 라. In vitro lactic acid osis의 발현 ...90
• 마. 산성 반추위액 내 lactate에 대한 조효소액의 효과 ...90
• 바. In vitro lactic acidosis에서 생균의 효과...91
• 사. 휘발성 지방산의 분석 ...91
• 아. Lactate, acetate와 pyruvate의 분석 ...91
• 자. 통계분석 ...92
• 3. 결과 및 고찰 ...92
• 가. 산성 사료에 의해 in vitro lactic acidosis의 유발 ...92
• 나. In vitro ruminal acidosis에 의한 lactate 축적에 대한 조효소의 효과 ...96
• 다. In vitro lactate 축적에 있어 LDH 생성 미생물 첨가의 효과 ...101
• 제3장 도축 반추위내용물을 이용한 효모 및 곰팡이 배양물 개발에 관한 연구 ...105
• 제1절 도축 반추위액을 이용한 효모 배양물 개발 ...105
• 1. 서 론 ...105
• 2. 재료 및 방법 ...106
• 가. 효모의 분리 및 동정 ...106
• 나. 효모의 증식조건 ...106
• 다. 반추위액 배지(W.R.E., D.R.E.) 제조 및 배양조건 ...106
• 라. 최적 배양조건 조사 ...107
• 1) 질소원 첨가 효과 ...107
• 2) 요소 첨가수준 ...107
• 3) 당밀 첨가 효과 ...107
• 4) 인과 칼륨 첨가 효과 ...107
• 5) 무기염류 첨가 효과 ...108
• 6) C/ N 비율이 효모 증식에 미치는 효과 ...108
• 마. Scale up 및 배양조건 개선 ...108
• 바. 조사항목 ...109
• 1) pH ...109
• 2) 생효모수 ...109
• 3) 환원당 함량 ...109
• 4) NH3-N 함량 ...109
• 5) 조단백질 함량 ...109
• 6) 효모 증식속도 ...109
• 7) 도축 반추위액의 아미노산 함량 ...110
• 8) 도축 반추위액의 광물질 함량 ...110
• 사. 통계분석 ...110
• 3. 결과 및 고찰 ...111
• 가. 효모의 선별 및 동정 ...111
• 나. 분리효모 SKK-Y-728, SKK-Y-786 및 SKK-Y-1293의 적정 생육 pH 및 온도 ...111
• 다. 반추위액 배지의 성분 ...116
• 라. 반추위액 함량이 효모 증식에 미치는 영향 ...118
• 1) SKK-Y-728 ...118
• 2) SKK-Y-786 ...122
• 3) SKK-Y-1293 ...125
• 마. 질소원 첨가가 분리 효모 SKK-Y-728, SKK-Y-786 및 SKK-Y-1293의 증식에 미치는 효과 ...128
• 1) SKK-Y-728 ...128
• 2) SKK-Y-786 ...131
• 3) SKK-Y-1293 ...133
• 바. 요소 첨가수준이 분리효모 SKK-Y-728, SKK-Y-786 및 SKK-Y-1293의 증식에 미치는 효과 ...135
• 1) SKK-Y-728 ...135
• 2) SKK-Y-786 ...137
• 3) SKK-Y-1293 ...139
• 사. 당밀 첨가수준이 분리효모 SKK-Y-728, SKK-Y-786 및 SKK-Y-1293의 증식에 미치는 효과 ...141
• 1) SKK-Y-728 ...141
• 2) SKK-Y-786 ...144
• 3) SKK-Y-1293 ...146
• 아. 인 및 칼륨 첨가가 분리효모 SKK-Y-728, SKK-Y-786 및 SKK-Y-1293의 증식에 미치는 효과 ...149
• 1) SKK-Y-728 ...149
• 2) SKK-Y-786 ...152
• 3) SKK-Y-1293 ...154
• 자. 무기염류 첨가가 분리효모 SKK-Y-728, SKK-Y-786 및 SKK-Y-1293의 증식에 미치는 효과 ...156
• 1) SKK-Y-728 ...156
• 2) SKK-Y-786 ...158
• 3) SKK-Y-1293 ...160
• 차. C/ N 비율이 분리효모 SKK-Y-728, SKK-Y-786 및 SKK- Y-1293의 증식에 미치는 효과 ...162
• 1) SKK-Y-728 ...162
• 2) SKK-Y-786 ...164
• 3) SKK-Y-1293 ...166
• 카. Scale u p 및 배양조건 개선 효과 ...168
• 1) SKK-Y-728 ...168
• 2) SKK-Y-786 ...171
• 3) SKK-Y-1293 ...174
• 제2절 도축 반추위내용물을 이용한 곰팡이 배양물 개발 ...177
• 1. 서 론 ...177
• 2. 재료 및 방법 ...178
• 가. 실험재료 및 사용균주 ...178
• 나. 반추위내용물을 이용한 Aspergillus oryzae 배양조건 ...178
• 1) 탄소원 결정 및 증자 효과 ...178
• 2) 수분함량 및 반추위내용물과 말분의 혼합비율 결정 ...178
• 3) 배양시간 결정 및 효소특성 조사 ...179
• 다. 고지배양조건 및 조효소액 제조 ...179
• 라. α-Amylase 및 protease activity 측정 ...179
• 3. 결과 및 고찰 ...180
• 가. 반추위내용물을 이용한 Aspergillus oryzae 배양조건 ...180
• 1) 탄소원 및 증자작업이 효소역가에 미치는 영향 ...180
• 2) 수분함량이 효소역가에 미치는 영향 ...181
• 3) 반추위내용물과 말분의 혼합 비율이 효소역가에 미치는 영향 ...182
• 4) 배양시간 ...185
• 나. A spergillus oryzae가 생성한 α-amylase 및 protease의 특성 ...186
• 1) 효소의 pH 안정성 ...186
• 2) 효소의 열 안정성 ...188
• 제3절 도축 반추위내용물을 이용한 효모 및 곰팡이 배양물 첨가가 가축의 소화생리에 미치는 효과 ...190
• 1. 서 론 ...190
• 2. 재료 및 방법 ...191
• 가. Saccharomyces sp . SKK-Y-728 배양물 제조 ...191
• 1) 반추위액 배지 제조 및 공시균주 ...191
• 2) Saccharomyces sp . SKK-Y-728 배양 ...192
• 3) Saccharomyces sp . SKK-Y-728 배양물 제조 ...192
• 4) Saccharomyces sp . SKK-Y-728 배양물의 생균수 및 성분 ...194
• 나. Aspergillus oryzae 배양물 제조 ...195
• 1) 반추위 내용물 배지제조 및 공시균주 ...195
• 2) Aspergillus oryzae 배양조건 ...195
• 3) Aspergillus oryzae 배양물 제조 ...196
• 4) Aspergillus oryzae 배양물의 효소역가 및 성분 ...198
• 다. Saccaromyces sp . SKK-Y-728 및 Aspergillus oryzae 배양물 급여가 반추위내 사료 이용률에 미치는 효과 ...199
• 1) 공시축 선정 및 사양관리 ...199
• 2) 시험사료 및 성분분석 ...199
• 라. 실험설계 ...201
• 마. 조사항목 ...202
• 1) 반추위내 pH 변화 측정 ...202
• 2) 시험사료의 소실율 측정 ...202
• 3) 반추위내 NH3-N 함량 측정 ...202
• 4) 반추위내 휘발성지방산 함량 측정 ...202
• 바. 통계분석 ...203
• 3. 결과 및 고찰 ...203
• 가. 조사료의 반추위내 소실율 ...203
• 1) 건물소실율 ...203
• 2) 유기물소화율 ...205
• 3) NDF 소화율 ...207
• 4) ADF 소화율 ...209
• 나. 반추위내 pH 변화 ...211
• 다. 반추위내 NH3-N 함량 ...213
• 라. 반추위내 휘발성지방산 함량 ...215
• 제4장 Chromosome homologou s integration 방법을 통하여 cellu lase를 생산하는 새로운 생균제의 개발 ...218
• 제1절 서 론 ...218
• 제2절 재료 및 방법 ...220
• 1. 섬유소를 분해 이용하는 미생물로부터 cellu lase 유전자의 bank화 ...220
• 2. Broad -h ost range vector의 수집과 chromosome integration vector의 선별 ...220
• 3. Proteinase-resistant한 cellulase 규명 ...220
• 4. 장관내에 우점하는 Lactic acid bacteria의 확보 ...221
• 5. Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus의 배양 ...221
• 6. Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus의 담즙산에 대한 내성조사 ...221
• 7. Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus의 항생제 감수성 조사 ...222
• 8. Strong promoter와 signal sequence를 함유하는 유산균 shuttle vector의 construction ...222
• 9. Homologous vector-free stable chromosomal integration을 위한 electrop horation 방법 개발 ...223
• 가. 재조합 p lasmid DNA의 E. coli MC1061로의 형질전환 ...223
• 나. 재조합 p lsmid DNA의 Lactobacilli sp .로의 형질전환 ...223
• 10. S-layer protein signal sequence를 장착한 vector construction ...224
• 가. S-layer protein signal sequence의 cloning ...225
• 나. 유산균용 vector의 구축 ...225
• 다. Siganl sequence와 cellulase gene의 ligation ...226
• 라. Cellu lase 발현 vector 구축 ...226
• 11. E. coli와 유산균에 형질전환 ...226
• 12. Cellulase 유전자의 발현양상 확인 ...227
• 제3절 결과 및 고찰 ...227
• 1. 활성도가 높은 cellulase 유전자 확보 ...227
• 2. Broad - host range vector의 수집과 shuttle vector의 선별 ...228
• 3. Proteinase-resistant한 cellulase 선별 ...228
• 4. Lactobacillus sp .의 생리적 특성조사 ...228
• 가. 내산성 조사 ...229
• 나. 내담즙성 조사 ...229
• 다. 항생제 감수성 조사 ...229
• 5. 본 연구에서 cloning한 cellulase 유전자 분석에 대한 결과 ...230
• 가. Fibrobactor succinogenes s85로부터 cloing한 CMC-Xylanase gene sequencing 결과 ...230
• 나. Actinomyces sp . 40으로부터 cloning한 endoglucanase gene sequencing 결과 ...230
• 다. Ruminococcus albus 7으로부터 cloning한 β-glucosidase gene sequencing 결과 ...231
• 6. Strong promoter와 signal sequence를 함유하는 유산균 shuttle vector의construction ...231
• 가. T7 RNA polymerase/ T7 promoter를 이용한 발현 system구축 ...231
• 나. 수행방법 ...231
• 1) T7 RNA polymerase를 발현하는 유산균 개발 ...231
• 2) T7 promoter에 의해 cellulase 효소 발현이 유도되는 vector (pNZT-cellu lase) 구축 ...232
• 3) 1항에서 개발된 T7 RNA polymerase가 homologous integration된 유산균에 2항의 vector 형질전환 ...232
• 7. E. coli와 Lactobacillus sp . 균주로 homologous vector-free stable ch romosomal integration을 위한 electrophoration 방법 개발 ...236
• 8. 새로운 cellulase발현을 위한 vector 구축 결과 ...237
• 가. 3가지 p romoter region의 cloning 결과 ...237
• 나. 최종 cellulase발현 유산균용 vector의 구축 ...237
• 9. Congo red test에의한 cellulase 발현양상 조사 ...238
• 가. E. coli JM 101에서 activity 확인 ...238
• 나. Lactobacillus reuteri에서 activity 확인 ...238
• 참고문헌 ...239
• 표지...260
• 최종보고서...261