초록 ▼

(제 1세부과제)
본 연구에서는 토양 내에 존재하는 beneficial microorganisms 중, 작물의 생산성을 증진시킬 수 있거나 잔류 유해농약의 분해 잠재력을 갖는 세균들의 생태.생리적인 특징을 연구하였다. 1997년 2월부터 1년간 경기도 용인지역의 벼 경작농지를 대상으로 이 곳에 존재하는 세균을 non-selective agar plates (예를 들면, R2A, AMA) 상에 colony로 성장시킨 후, 이 중에서 방향족화합물질의 분해균 및 질소고정균의 수를 정량 하였다. 이를 위하여 nitrogen-fixin

(제 1세부과제)
본 연구에서는 토양 내에 존재하는 beneficial microorganisms 중, 작물의 생산성을 증진시킬 수 있거나 잔류 유해농약의 분해 잠재력을 갖는 세균들의 생태.생리적인 특징을 연구하였다. 1997년 2월부터 1년간 경기도 용인지역의 벼 경작농지를 대상으로 이 곳에 존재하는 세균을 non-selective agar plates (예를 들면, R2A, AMA) 상에 colony로 성장시킨 후, 이 중에서 방향족화합물질의 분해균 및 질소고정균의 수를 정량 하였다. 이를 위하여 nitrogen-fixing bacteria는 nifH, 그리고 aromatic ring cleavage에 관여하는 bacteria는 todCBA, xylL, 그리고 tmoABCDE를 coding하는 gene probes를 사용한 DNA hybridization 방법으로 그들의 양 및 계절적인 분포를 조사하였으며, 방향족화합물질의 분해에 관여하는 유전정보를 갖는 bacteria의 degradation phenotype의 확인을 위하여 benzene (B), toluene (T), 또는 p-xylene (X)이 sole carbon source인 agar plates에서 성장하는 colony의 수와 종류도 함께 조사하였다.
각 계절별 (온도, 수분 등의 환경요인의 변화) 그리고 농사활동 (모내기, 농약살포, 추수 등) 중에 채취한 soil samples 내의 총 colony-forming-units (CFU) 수는 대체적으로 큰 변화가 없었다. 그러나 nif에 hybridization하는 세균의 수는 모내기 후 그리고 추수 전 동안 그 수가 약간 증가하여, 총 CFU의 약 20% 정도를 유지하였다. 농약 살포 후 2주일이 지난 bacterial community는 그 조성에서 큰 변화를 보였는데, 즉 BTX를 분해하는 균의 괄목할만한 증가가 나타났으며 이러한 분해균 중에는 tod, xyl, 그리고 tmo 등의 알려져 있는 유전자를 갖고있지 않으면서도 농약의 주성분인 방향족화합물의 분해능이 뛰어난 세균이 총 분해세균 중 약 32%를 차지하였다. 이러한 토양세균군락의 역동적인 변화를 이해하고자 다음과 같은 인공토양 및 자연토양 하에서의 주요세균의 생존 및 활성을 조사하였다.
Aromatic ring cleavage 또는 nitrogen fixation 능력을 갖는 균 중, soil bacterial community에서 우점종을 차지하며, 그들의 detection이 용이한 (예를 들면, specific DNA probe에만 hybridization하거나, 특별한 carbon plate에서만 성장하며, 그리고 특이한 colony morphology를 갖춘 균) 3개 및 대조(control)균 1개의 bacterial isolates를 선별하여 여러 환경조건 하의 microcosm에서 함께 접종한 후 각 균의 CFU 변화를 살펴보았다. 이로부터 여러 주요 environmental parameters가 in situ bacterial community의 변화에 영향을 끼칠 수 있는 조건들을 조사하였다.
(제 2세부과제)
본 연구에서는 자연계로부터 농약분해능이 우수한 균주를 확보하고, 이를 배양하여 국내 농업 토양 내에 투입함으로서 인위적인 유용토양 미생물 공동체를 구성시켜 토양 활성의 회복을 연구하였다. 무지배지(C-배지)를 제조하고 탄소원으로 2,4-D와 같은 염화방향족 화합물을 함유하고 있는 농약을 사용하여 10균주의 분해미생물을 분리하였으며 분리된 균주의 생장여부 및 분해능력을 조사하였다. 토양이 식물육종에 필요한 수소이온 농도를 벗어나 점점 산성화, 알칼리화 되어감에 따라 분리된 미생물의 산·알칼리 환경에서의 생육특성에 대해 조사한 결과 pH4.0부근에서 생육이 가능한 균도 있었고 pH11.5까지 생육이 가능한 균도 있었다. 폐농약과 같은 유해화합물을 대량으로 생물학적 처리할 때 유용하게 이용되어질 수 있는 유기용매내성에 관한 조사를 한 결과 3개의 균주가 LogP 3.1인 xylene에서 생육 가능한 것을 나타났다. 분리된 균주들은 다양한 생리화학적인 시험을 거쳐 동정되었다.
염소화된 농약은 치환된 염소의 위치(ortho, para, meta)에 따라 분해정도가 다르다. 같은 종의 미생물이라도 phenyl기에 치환된 side group의 종류에 따라 분해되고 분해되지 않는 경우가 많다. 따라서 이러한 위치에 치환된 농약을 완전 분해를하기 위해선 기질특이성이 서로 다른 미생물간의 상호작용이 필요하다. 이를 위해 분리된 균주에 대하여 각종 농약 및 방향족화합물에 대한 기질특이성을 조사하였다. 농약분해능이 우수한 균주를 선택하여 최적 온도, 최적pH, 최적기질농도등 최적배양조건을 조사한 결과 35℃가 최적온도였으며, 기질농도 0.3%에서 가장 높은 효소활성을 보임으로서 최적 기질 농도로 결정되었고 최적 pH는 8.5와 9로 나타났다. 농약분해에 관련된 main degradation pathway에 관련되어 있는 효소의 유전자를 cloning하였다.
이 유전자는 농약분해 미생물이 실제로 현장에 뿌려졌을 경우, 우량균주들의 토양 내에서의 생존성을 추적하고 어떠한 변화를 겪게되는지를 보기 위한 monitoring용 probe로서 사용되었다.
농약분해미생물 중 우량 균주를 선별하여 톱밥, 쌀겨, 활성탄을 이용하여 고정화하고 그 저장효율성을 측정하였다. 실제의 토양 내에서 고정화된 우량 균주의 활성과 시간에 따른 생존을 측정하였으며 외부환경인자와의 관계를 조사하였다.
(제 3세부과제)
본 연구에서는 국내토양환경에 적응력 높은 백색부후곰팡이를 선발하고 동시에 기존의 분해력이 높은 균주를 변이 시켜 리그닌 분해에 관련하는 효소의 역가가 증진된 균주를 확보한다. 확보된 균주의 균사체 성장 및 효소 생산 최적 조건을 실험실 규모에서 검토한 후, 리그닌이 다량 함유된 볏짚에 적용하여 균사체 및 효소가 분해하는 리그닌 및 농약 (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid) 분해율을 측정하였다.
또한 볏짚 분해 최대화를 위해서 균사체 및 효소의 고정화 기술을 hollow fiber, 패각, alginate, carrageenan을 이용하여 검토하였고, 배양액 중의 조 효소액을 농축하여 볏짚 분해에 적용하였으며 최종적으로 균사체를 왕겨를 이용하여 pellet을 만들어 모델 토양에 적용하여 토양중의 볏짚 리그닌 및 농약의 분해를 연구하였다.

Abstract ▼

(제 1세부과제)
Analyses of the natural agricultural soil showed that the proportion of the bacteria degrading aromatic compounds and hybridizing to the corresponding gene probes increased rapidly after pesticide treatment. The major environmental factors affecting the dynamics of microorganisms were t

(제 1세부과제)
Analyses of the natural agricultural soil showed that the proportion of the bacteria degrading aromatic compounds and hybridizing to the corresponding gene probes increased rapidly after pesticide treatment. The major environmental factors affecting the dynamics of microorganisms were tested by estimating their effects on four representative bacterial isolates in the paddy field at Yongin; a potential nitrogen-fixer SJ-N3, a todCBA-hybridizing SJ-T27, a xylL-hybridizing SJ-X9, and one strain SJ-44 neither degrading aromatic compounds nor hybridizing to the above probes. Each bacterial cell in soil microcosms retained its initial cell number for 2-3 months of incubation at 20℃. To look at the effect of pesticides, as we have seen in the natural condition, the pesticides such as edifenphos and diazinon which had been frequently used after rainy season (Jul.-Aug.) were added to the soil microcosm containing four bacterial strains. SJ-44 has not been detected at all by plate-counting, and SJ-N3 and SJ-T27 tempor rily decreased in their CFUs followed by rapid increase in their CFUs. SJ-X9 which hybridizes to xyl probe and utilizes aromatic compounds as a sole carbon source, however, is negatively affected by the presence of the pesticides. In addition, the low pH which could be derived from the degradat on products of S- or P-organic compounds did not support the long-term survival of SJ-X9. In conclusion, it appears that the pesticide-treatment, among the various environmental parameters, to soil greatly effects on the microbial composition through the year.
(제 2세부과제)
10 strains are isolated from soils and wastewaters after the culture in a minimal medium containing 2,4-D or other ring-cleavage compounds as the sole carbon source, and the strains that can effectively degrade 2,4-D under the stress of unfavorable conditions is selected by using the variety of aromatic compounds and organic solvents. The selected isolates are identified as Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. based on their morphological and physiological characteristics. In addition, the enzyme activity is investigated on the substrates of meta-ring cleavage dioxygenase in the isolate. The result shows that Pseudomonas sp. strains have a wide selectivity in the specificity of meta-cleavage dioxygenase for substrates. Also, the isolated strains are tested to examine the organic solvent tolerance. The result shows that three strains can grow in xylene in the organic solvent of the logP value of 3.1.

목차 Contents

• 최종보고서 ...1
• 제출문 ...2
• 요약문 ...3
• SUMMARY ...11
• CONTENTS ...14
• 목차 ...21
• 제 1 장 서 론 ...28
• 제1절 연구개발의 목적 ...28
• 1. 필요성 ...28
• 2. 목적 ...31
• 제2절 연구개발의 범위 ...31
• 1. 농지 유용 미생물공동체의 생태학적인 분석?확보 및 생물공학적인 이용 ...32
• 2. 농약분해 미생물을 이용한 토양오염정화 기술 개발 ...32
• 3. 농업에 유용한 목질계 곰팡이의 육종기술 개발 ...32
• 제 2 장 농지 유용 미생물공동체의 생태학적인 분석?확보 및 생물공학적인 이용분야 ...33
• 제1절 서 설 ...33
• 제2절 농업 토양내의 유용 미생물공동체의 정량 및 정성적인 분석 ...35
• 1. DNA probe의 확보 및 개발 ...35
• 가. Toluene dioxygenase ...35
• 나. Toluene-4-monooxygenase ...35
• 다. cis-p-toluate-dihydrodiol dehydrogenase ...36
• 라. Dinitrogenase component II (nitrogenase reductase) ...36
• 2. Colony hybridization, dot-blot hybridization 방법 및 specific carbon plate 상에서의 성장 조사를 통한 유용 미생물의 정량 및 정성적인 분석 ...36
• 가. Optimal conditions for DNA hybridization ...36
• 나. Selection of media for growth of soil microbial assemblage ...38
• 다. Treatment of soil microbial assemblage ...39
• 라. Specific carbon plate 상에서의 성장 조사 ...40
• 마. Colony hybridization; ...41
• 제3절 인공 모델토양 microcosm 내에 혼합 미생물의 조성 및 미생물상호간 및 환경인자에 의한 조성 변화 관찰 ...42
• 1. Microcosm에 사용할 균주의 선택 ...43
• 가. SJ-N3의 nifH amplification 결과 ...45
• 나. 각 균의 gene probes에 대한 hybridization 결과 ...46
• 다. Selected bacterial isolates의 특징의 정리 ...47
• 2. microcosm 실험 조건의 확립 ...47
• 가. 선택된 세균의 접종 ...47
• 나. Microcosm에 접종 시 각 균의 mixing 효율의 조사 ...48
• 다. 각 bacterial cells의 정량 ...49
• 3. microcosm의 배양조건에 따른 각 세균의 생존도 측정 ...49
• 가 온도 ...49
• 나. 영양결핍 조건 ...49
• 다. 각 세균간의 경쟁관계 (competition) ...51
• 라. 농약에 노출시킨 microcosm ...52
• 1) 다양한 토양세균의 히노산에 대한 영향조사 ...52
• 2) 농약의 영향 ...53
• 가) M9 microcosm에서 ...53
• 나) soil microcosm에서 ...54
• 제4절 보다 많은 종류의 환경인자 및 미생물 상호 간의 관계 연구 후, 실제 논 토양내에 투입한 혼합미생물의 생존 및 혼합미생물 조성의 변화 조사 ...57
• 1. Microcosms를 이용한 비료, 온도, pH에 대한 영향 평가 ...57
• 가. 비료의 영향 ...57
• 나. 동절기의 영향 ...58
• 다. pH의 영향 ...59
• 2. in situ soil microcosm에서의 접종 미생물군의 생존도 ...59
• 가. colony 특징에 의한 분석 ...59
• 나. 각 세균의 방향족화합물의 분해능 및 colony hybridization 특징에 의한 분석 ...60
• 제5절 결 론 ...62
• 1. 생태학적 고찰 ...62
• 2. 인공토양모델 고찰 ...62
• 제6절 참고문헌 ...63
• 제 3 장 농약분해 미생물을 이용한 토양오염정화 기술 개발분야 ...67
• 제1절 서설 ...67
• 제2절 극한 환경으로부터 유해농약 분해능을 가진 미생물의 분리 및 동정 ...68
• 1. 연구수행방법 ...68
• 가. 분해미생물의 분리 ...68
• 나. 기질특이성 및 유기용매내성 조사 ...70
• 다. 분해균주의 동정 ...71
• 2. 연구수행 내용 및 평가 ...71
• 가. 농약분해 미생물의 분리.동정 ...71
• 나. 방향족화합물 분해능력 실험 ...72
• 다. meta-cleavage enzyme의 기질특이성 조사 ...75
• 라. 유기용매 내성실험 ...76
• 제3절 분리된 미생물의 상호관계 및 우량균주군 선발 ...77
• 1. 연구수행방법 ...77
• 가. Cloning methods ...77
• ㄱ. pDNA preparation as a cloning vector ...79
• ㄴ. Competent cell preparation ...79
• ㄷ. Transformation method ...79
• ㄹ. cDNA preparation ...79
• ㅁ. cDNA partial digestion with restriction enzyme and extraction from agarose gel ...79
• ㅂ. Plasmid extraction method ...79
• ㅅ. Extracted pUC119 restriction enzyme treatment ...80
• ㅇ. CIAP treatment ...80
• ㅈ. Ligation, gene expression and final verification ...80
• 나. Substrate specificities of recombinant plasmids in E. coli DH5α ...80
• 다. Subcloning of recombinant plasmids ...80
• 라. Restriction Mapping ...81
• 마. Deletion Mutants method와 sequence 분석 ...81
• 바. Optimum temperature, pH and concentration ...81
• 2. 연구수행 내용 및 평가 ...83
• 가. Cloning of DY3 ...83
• 나. Recombinant plasmids의 기질 특이성 ...84
• 다. Subcloning of recombinant plasmid pSY2 ...84
• 라. Restriction Mapping ...86
• 마. Deletion Mutants와 sequence 분석 ...86
• 바. Optimum temperature, pH and concentration ...94
• 제4절 우량균주들의 토양내 활성 및 생존성의 증진 ...96
• 1. 연구수행방법 ...96
• 가. 각종 media를 이용한 균의 혼합저장 ...96
• 나. 토양중의 균수측정 ...97
• 2. 연구수행 내용 및 평가 ...98
• 가. 각종 media를 이용한 균의 혼합저장 후 균의 성장 ...98
• 나. 저장 온도에 따른 균의 성장 ...100
• 다. 토양중의 균수측정 ...102
• 제5절 결론 ...105
• 제6절 참고문헌 ...106
• 제 4 장 농업에 유용한 목질계 곰팡이의 육종기술 개발분야 ...110
• 제1절 서 설 ...110
• 1. 연구개발의 목적과 범위 ...110
• 2. 참고문헌 ...111
• 제2절 백색부후곰팡이(white-rot fungi)의 자연계 분리, 개선 및 특성 ...111
• 1. 서 설 ...111
• 2. 재료 및 방법 ...112
• 가. 균주 ...112
• 나. 변이 유도 및 자연계 백색부후 곰팡이의 분리용 배지와 배양조건 ...112
• 다. 자외선에 의한 변이 유도 ...114
• 라. 자연계로부터 백색부패곰팡이의 분리 및 선별 ...114
• 마. 균사체 및 lignin peroxidase 생성 배양 조건 ...114
• 바. P. chrysosporium의 lignin peroxidase생산의 최적 조건 검토 ...115
• 사. 효소 분석 ...115
• a. Lignin peroxidase1 ...115
• b. Mn(Ⅱ)-dependent peroxidase2 ...116
• c. Laccase3,4 ...116
• 아. glucose 소비량 측정 ...116
• 자. 균체 건조 중량 ...116
• 차. 백색부후 곰팡이에 의한 볏짚 리그닌 분해 실험 ...116
• 카. Klason lignin 정량 ...116
• 3. 결과 및 고찰 ...116
• 1. 변이에 의한 P.chrysosporium의 생존율 ...116
• 2. 균주의 선별 ...117
• 3. 변이주 및 자연계 분리 백색 부후 곰팡이가 생산하는 LiP ...119
• 4. P. chrysosporium의 LiP 생산의 최적 조건 ...119
• 5. 볏짚 중의 리그닌 분해 효과 ...122
• 4. 참고문헌 ...122
• 제3절 백색부후곰팡이의 최적 리그닌 분해 조건 확립 ...123
• 1. 서 론 ...123
• 2. 재료 및 방법 ...125
• a. 사용 균주 ...125
• b. 배양 ...125
• 가. P. chrysosporium ATCC 24725 및 Wood A ...125
• 나. T. versicolor MD 277 ...127
• c. 실험 인자 ...127
• d. 효소역가 측정 및 각종분석 ...127
• 가. lignin peroxidase (LiP)1 ...127
• 나. Manganese peroxidase (MnP) 2,3 ...127
• 다. Laccase의 역가 측정4 ...128
• e. 리그닌 분해 및 리그닌 정량 (modified Klason method) ...128
• f. P. chrysosporium 균사체에 의한 농약 2, 4, 5-trichlorophenoxy acetic acid (2, 4, 5-T) ...128
• g. HPLC 분석 ...128
• 3. 결과 및 고찰 ...128
• a. 백색부후곰팡이 (P. chrysosporium) 균사체의 토양적용 조건 검토 ...128
• b. 제초제 2, 4, 5-trichlorophenoxyacetic acid (2, 4, 5-T) 분해 ...130
• c. 선별 백색부후곰팡이의 고체배양에 의한 볏짚 리그닌 분해 ...132
• d. 미량원소의 영향 ...133
• e. pH의 영향 ...136
• f. 배양기간의 영향 ...136
• 4. 참고문헌 ...140
• 제4절 백색부후곰팡이의 고정화 연구 및 토양적용 ...140
• 1. 서 론 ...140
• 2. 재료 및 방법 ...141
• a. 균주 ...141
• b. 균주의 배양 ...141
• c. 효소분석 ...143
• d. 계면활성제(tween 80)의 영향 ...143
• e. 백색부후곰팡이로부터 생산된 효소 정제 및 농축 ...143
• 가. 배양액 농축 ...143
• 나. FPLC 분리 ...143
• f. 효소의 고정화 및 볏짚, 왕겨 적용 ...143
• 가. 효소의 고정화 ...143
• 나. 고정화 효소의 볏짚 및 왕겨 분해 ...144
• g. 효소적용기술 ...144
• h. 백색부후곰팡이에 의한 토양 중 2,4,5-T 분해 ...144
• i. HPLC 분석 ...146
• 3. 결과 ...147
• 1. P. ostreatus를 위한 고체배지 및 액체배지 ...147
• 2. tween 80의 영향 ...147
• 3. 효소의 농축 및 정제 ...150
• 가. 배양액(효소액) 농축 ...150
• 나. Lignin peroxidase 분리 ...152
• 4. 효소 및 고정화 효소에 의한 볏짚 분해 ...152
• 5. 고체배지에 disk 적용 ...153
• 6. 백색부후곰팡이에 의한 토양 중 2,4,5-T 분해 ...153
• 7. 참고문헌 ...155
• 제5절 국내 토양의 목질계 폐자원 실태조사 ...156