초록 ▼

◎ Salmonella를 포함한 7종 이상의 병원성 세균을 타겟으로 하는 동시/다중 검출용 REBA 및 액상바이오칩의 개발
- REBA system 개발
방류수 내 유해미생물인 병원성 세균 중7종을 증폭할 수 있는PCR primer 및 7종에(E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Mycobacterium spp.)해당하는 probe와 더불어 E. coli O157:H7, Cit

◎ Salmonella를 포함한 7종 이상의 병원성 세균을 타겟으로 하는 동시/다중 검출용 REBA 및 액상바이오칩의 개발
- REBA system 개발
방류수 내 유해미생물인 병원성 세균 중7종을 증폭할 수 있는PCR primer 및 7종에(E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Mycobacterium spp.)해당하는 probe와 더불어 E. coli O157:H7, Citrobacter spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Listeria spp., gram negative, gram positive bacteria에 종 특이적으로 반응할 수 있는 probe와 16s rRNA를 가지는 모든 균종에 반응할 수 있는 probe도 제작하여 REBA system을 확립.
- 액상바이오칩의 개발
REBA system에서 확립한 7종의 미생물 검출용 probe로 액상바이오칩에 사용하는 미세구체 비드 제조 및 SOP 확립
◎ 방류수내 유해미생물 오염도 모니터링을 위한 새로운 지표미생물 제안
방류수 시료를 대상으로 고전적인 미생물학적 동정 방법과 상용화된 kit를 이용한 동정법의 실험결과, 대장균군 이외에 Pseudomonas spp., Yersinia spp.와 Enterococcus spp., Listeria spp., Staphylococcus spp. 등을 수질기준 지표세균으로 추가하여 사용할 가능성이 있을 것으로 사료.
◎ 분자생물학적 기법의 현장 매뉴얼확립
- 수 처리시설에서 방출되는 방류수 환경에서 병원성 세균을 신속하게 검출할 수 있는 분자생물학적 모니터링시스템 확립하여 3차년도에 걸쳐 가톨릭 대학교에서 제공받은 7지역의 방류수로 방류수에서 검출될 수 있는 대상세균에 대한 유용성을 평가함.
-원주 환경친화기술센터의 수질검사센터와의 협력을 통해3차년도에 걸쳐 확립한 분자생물학적 기법들인 REBA system과 액상바이오칩의 현장 적용을 시험하고 현장에서 사용가능한 매뉴얼을 확립.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...3
• 보고서 초록 ...5
• 목차 ...9
• 표목차 ...14
• 그림목차 ...16
• Table of Contents ...21
• List of Tables ...26
• List of Figures ...28
• 제1장 서론 ...33
• 가.연구개발의 중요성 및 필요성 ...33
• (1) 연구개발의 필요성 ...33
• (가) 방류수 ...33
• (나) 방류수 기준 ...33
• (다) 국내 하수 종말 처리장의 현황 및 수질 ...34
• (라) 병원성세균의 모니터링 지표세균 - 대장균 ...40
• (마) 동시/다중 미생물검사법개발의 필요성 ...41
• (바) 새로운 미생물지표 세균의 제안 ...42
• (사) 액상바이오칩 기술의 원리 ...43
• (아) 액상바이오칩 기술의 장점 ...43
• (2) 연구의 기술적/산업적 중요성 ...45
• 나.연구개발의 국내외 현황 ...46
• (1) 세계적 수준 ...46
• (2) 국내 수준 ...47
• (3) 국내외의 연구현황 ...48
• 다.연구개발대상 기술의 차별성 ...49
• (1) 차별성 ...49
• (2) 관련기술 보유현황 ...49
• 제2장 연구개발의 목표 및 내용 ...51
• 가.연구의 최종목표 ...51
• 나.연도별 연구개발의 목표 및 평가방법 ...52
• 다.연도별 추진체계 ...53
• 제3장 연구개발 결과 및 활용계획 ...55
• 가.연구개발 결과 및 토의 ...55
• (1) 방류수에서의 병원성 세균의 분리 동정 ...55
• (가) 방류수 시료의 채취 및 처리 ...55
• ①시료 채수지 ...55
• ② 시료채수 ...60
• (나) 방류수의 환경인자분석 ...60
• ①현장의 환경인자 분석방법 ...60
• ②방류수의 환경요인 측정 결과 ...60
• ㉮계절별 BOD의 변화 ...66
• ㉯계절별 COD의 변화 ...67
• ㉰계절별 T-N의 변화 ...68
• ㉱ 계절별 PO4-P의 변화 ...69
• ㉲계절별 SS의 변화 ...70
• (다) 방류수의 미생물의 분포 ...71
• ① 지표미생물(대장균, 대장균군, 장내세균) 및 황색포도상구균 분포 ...71
• ㉮총 세균에 대한 각 하수처리장의 계절별 분포도 ...72
• ㉯ 대장균 (E. coli)에 대한 각 하수처리장의 계절별 분포도 ...73
• ㉰대장군균 (Coliform)에 대한 각 하수처리장의 계절별 분포도 ...74
• ㉱ 장내세균군 (Enterobacteria)에 대한 각 하수처리장의 계절별 분포도...75
• ㉲ 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)에 대한 각 하수처리장의 계절별 분포도 ...76
• ㉳효모/곰팡이 (yeast/mold)에 대한 각 하수처리장의 계절별 분포도 ...77
• ②각 하수처리장별 환경인자와 미생물 개체수간의 비교 ...78
• ③방류수내에 지표 미생물 및 수인성 병원성 미생물분포 ...83
• (2) 새로운 미생물 지표세균의 제안 ...85
• (3) 액상 바이오칩 개발을 위한 REBA 의 개발 확립 ...91
• (가) 16s rRNA gene을 타겟으로 nested PCR 제작 및 확립 ...91
• ①16s rRNA primer 고안 및 제작 ...91
• ②실험에 사용된 표준균주 및 DNA 추출 ...92
• ③ 수인성 병원균과 각종 장내세균 증폭을 위한 16s rRNA primer의 유용성 확인 ...94
• ④16s rRNA primer를 이용한 PCR방법의 민감도 측정 ...95
• (나) 16s rRNA Probe고안 및 제작 ...95
• ①16s rRNA Probe 고안 및 제작 ...95
• ②16s rRNA Probe 사용하여 Reverse blot hybridization(REBA) 실시 ...96
• (4) 7종 미생물 검출용 액상바이오칩의 개발 확립 ...99
• (가) 액상바이오칩에 사용하는 미세구체 비드 제조 ...99
• (나) 검출할 병원성 미생물의 표준물질 확보 ...100
• (다) 병원성 미생물의 PCR 증폭 ...101
• (라) 액상바이오칩의 교잡반응 조건 설정 ...101
• ①Hybridization buffer의 조성 설정 ...102
• ②PCR product의 사용량 설정 ...102
• ③Streptavidin-Cy3 혹은 Streptavidin-phycoerythrin의 설정 ...103
• ④Streptavidin-phycoerythrin의 labeling 방법 ...103
• ⑤Hybridization time의 설정 ...104
• ⑥Hybridization temperature의 설정 ...104
• (5) REBA system을 사용하여 방류수에서 검출될 수 있는 대상세균에 유용성 평가 ...105
• (가) Reverse blot hybridization(REBA)의실시 ...105
• (나) REBA system을 사용하여 방류수에서 검출될 수 있는 대상세균에 유용성 평가 ...106
• (6) 액상바이오칩을 사용하여 방류수에서 검출될 수 있는 대상세균에 유용성 평가 ...118
• (7) 기존 미생물 배양법에 의한 검출법과 7종 미생물 검출용 분자생물학적 모니터링 시스템의 특이도 및 민감도 비교분석 ...124
• (가) REBA의 검출 특이도 및 민감도를 표준균주를 이용하여 분석 ...124
• ① REBA system 적용 시 검출대상 세균에 대한 specific probe의 특이도 검증 ...124
• ② REBA system 적용 시 검출대상 세균에 대한 specific probe의 민감도 확인 ...125
• (나) 액상바이오칩의 검출 특이도 및 민감도를 표준균주를 이용하여 분석 ...126
• ① 액상바이오칩 적용 시 검출대상 세균에 대한 specific probe의 특이도 검증 ...126
• ② 액상바이오칩 적용 시 검출대상 세균에 대한 민감도 확인 ...127
• (8) 개발된 분자생물학적 모니터링 시스템들 간의 검출도 및 민감도 비교분석 ...133
• (가) 개발된 분자생물학적 모니터링 기법인 REBA와 액상바이오칩의 검출 특이도와 민감도를 표준균주를 사용하여 비교 ...133
• (나) 개발된 분자생물학적 모니터링 시스템들 간의 검출 특이도 및 민감도를 방류 수를 대상으로 비교분석 ...133
• (9) 분자생물학적 기법의 현장 적용 및 매뉴얼확립 ...139
• (가) 개발된 7종 미생물 검출용 분자생물학적 모니터링 기법들을 사용하여 방류수에서 검출될 수 있는 대상 세균에 모니터링 확립 ...139
• (나) 분자생물학적 기법의 매뉴얼 확립 ...139
• (10) REBA system 최적화 및 시제품 개발 ...144
• (11) 액상바이오칩의 최적화 및 시제품 개발 ...145
• 나.연구개발 결과 요약 ...146
• (1) 방류수내 유해미생물 오염도 모니터링을 위한 새로운 지표미생물 제안 ...146
• (2) Salmonella를 포함한7종 이상의 병원성 세균을 타겟으로 하는 동시/다중 검출용 REBA 및 액상바이오칩의 개발 ...146
• (가) REBA system 개발 ...146
• (나) 액상바이오칩의 개발 ...146
• (다) 개발된 분자생물학적 기법들을 표준균주를 이용하여 액상 바이오칩의 특이도 및 민감도 확립 ...147
• (라) 개발된 분자 생물학적 기법의 유용성 평가를 위해 방류수 시료 적용 ...147
• (3) 방류수의 미생물오염도 모니터링 매뉴얼 확립 ...148
• (4) 개발된 분자생물학적 기법들의 최적화 및 시제품 개발 ...148
• (가) REBA system 최적화 및 시제품 개발 ...148
• (나) 액상바이오칩의 최적화 및 시제품 개발 ...148
• 다.연도별 연구개발목표의 달성도 ...149
• 라.연도별 연구성과(논문.특허 등) ...150
• (1) 논문 및 특허 ...150
• (가) 수인성 병원미생물 검출용 키트 ...151
• (나) 병원성 미생물 동정을 위한 올리고뉴크레오타이드, 그것을 포함하는 서스펜션 어레이의 마이크로스피어 비드 조성물 및 그 검사 방법 ...151
• (다) 수인성 병원성 미생물의 검출하기 위한 Real- time PCR용 프라이머 및 프로브 ...151
• (2) 학술회의발표 성과 ...152
• 마.관련분야의 기술발전 기여도 ...153
• 바.연구개발 결과의 활용계획 ...154
• 제4장 참고문헌 ...157
• 부 록 ...161
• 방류수의 미생물오염도 모니터링의 현장 매뉴얼 확립-REBA system ...161
• 방류수의 미생물오염도 모니터링의 현장 매뉴얼 확립-액상바이오칩 ...188