초록 ▼

1. 연구목적
▶ 호발성 유방암의 대부분에서 특이적으로 과발현되어 유방앙을 유발하는 PTK6의 각 활성 domain들 몇 조절인자인 Linker부위와의 복합체에 대하여 삼차원 구조와 기능을 핵자기 공명 분광학 및 분자 동릭학 기법을 사용하여 결정하고, 각 활성 부위와 조절부위들의 결합기작을 규명함. 또한 결정된 복합체들의 삼차원 구조와 생리 활성과의 상관관계 정보를 통하여 Virtual Screcning 및 NMR-based Screening 방법을 통하여 효율적인 PTK6 활성 저해재를 탐색하고, 단색된 저해제와 PTK6의

1. 연구목적
▶ 호발성 유방암의 대부분에서 특이적으로 과발현되어 유방앙을 유발하는 PTK6의 각 활성 domain들 몇 조절인자인 Linker부위와의 복합체에 대하여 삼차원 구조와 기능을 핵자기 공명 분광학 및 분자 동릭학 기법을 사용하여 결정하고, 각 활성 부위와 조절부위들의 결합기작을 규명함. 또한 결정된 복합체들의 삼차원 구조와 생리 활성과의 상관관계 정보를 통하여 Virtual Screcning 및 NMR-based Screening 방법을 통하여 효율적인 PTK6 활성 저해재를 탐색하고, 단색된 저해제와 PTK6의 결합가기작 연구를 통하여 유방암 치료제 개발을 위한 핵상 정보 추출함.
2. 연구방볍
▶ PTK6의 각 활성 부위와 조절부위의 결합 기작 연구
: 대장균에서 각 domain들을 과다 발현 및 분리, 정제함. 순수한 단백질을 획득한 후 핵자기 공명 분광학과 분자 설계법을 사용하여 삼차원 구조를 통하여 결합 기작을 규명함.
▶ PTK6 의 저해제(Linker)와 PTK6 의 결합기작 및 결합구조 연구
: NMR을 이용한 SH3 domain과 Linker의 구조를 규명하고 NMR titration, ITC, Fluorescence 기법 등을 사용하여 저해제와 PTK6와의 결합기작 및 삼차원 구조를 규명함.
▶ NMR 및 Virtual Scrcening (Pharmacophore scrcening)
: PTK6와 저해제의질합구조를 결정하고 이를 통하여 PTK6의 저해제 후보물질을 도출한다. 도출된 후보물질에 대하며 결합력과 저해능럭을 검증하여 최종 후보물질 2개를 제시함.
3. 연구결과
▶ PTK6 의 구조연구 결과
: NMR을 통하여 PTK6의 autoinhibition 에 관여하는 SH3 domain과 Linker domain의 삼차원 구조를 규명하였음. Linker (저해재)의 SH3 domain 결합구조를 규명하여 비교함으로 결합에 따른 구조의 변화를 규명하였음
▶ PTK6의 저해제와 SH3 domain 의 결합구조연구
: ITC 와 NMR titration을 이용하여 SH3와 Linker peptide의 specific interaction을 규명 하였음. mutation studie를 통하여 서로간의 결합기작을 규명하고 NMR을 이용하여 SH3/Linker complex 구조틀 규명하였음.
▶ NMR 및 V？rtual Screening (Pharmacophore screen？ng)
: 규명된 SH3.Linker complex 구조를 이용하여 pharmacophore screening을 실시하였음. 결과로부터 16개의 후보물질을 발굴하였고 이를 fluorescence 실험과 kinase assay를 동하여 검증하였음. 검증결과 가장 강하게 결합하며 autoinhibition 효과를 가장 크게 향상시키는 2개의 최종 후보 물질을 도출하여 제시하였음.
4. 기대효과
: PTK6 의 삼차원 구조에 가반한 유방암 저해제 후보물질의 성공적인 발굴로 새로운 신약개발이 기대되며 PTK6의 autoinhibition mechanism에 관련된 학문적 연구가 활발해 칠것으로 기대됨

Abstract ▼

1. Object
▶ PTK6 which IS over-expressed m breast cancer consists of three domains, SH2, S113, catalytic domain. In this study, we will resolve the solution structure of PTK6 and elucidate the regulation mechanism of PTK6 kinase through the autoinhibition. Based on the solution structure of PTK6,

1. Object
▶ PTK6 which IS over-expressed m breast cancer consists of three domains, SH2, S113, catalytic domain. In this study, we will resolve the solution structure of PTK6 and elucidate the regulation mechanism of PTK6 kinase through the autoinhibition. Based on the solution structure of PTK6, the new drug candidates will be proposed and validated by the structure based drug design method which contains the structure deten11ination. pharmacophore scfeening and affinity measurement.
2. Methods
▶ Sample preparation of PTK6 for structural studies
: The E.coli expression and purification system was applied to the structural studies of PTKG. the purified protein was applied to FPLC system to get the high purity and executed NMR. experiments for structure determination.
▶ Nl\IR spectroscopy of PTK6s
The SI13 domain and Linker domain of PTKG were performed NMRexperiments for structure determination. Based In the resonance assignments the CY ANA calculations were executed and the solution structure of SH3, Linker was revealed. To figure out the binding affinity between SIB and Linker, ITC experiments were applied.
▶ NMR studies for complex structure and pharmacophore screening
: The complex structure of SH3.Linker was calculated by HADDOCK program based on the NMR titration and mutation studies. the pharmacophore screemng based on the complex strcuture was performed and it proposed the final two candidates.
3. Hesults
▶ The structural studies of PTK6s
The solution structure of SH3 and Linker was resolved by NMR spectroscopy. And the structure of Linker bound to SH3 was elucidated and compared to free form of it.
▶ The complex stmcture of SH3 and Linker by NMR spectroscopy
The complex structure of SH3/Linker was revealed. the structure was calculated by HADDOCK program that used the complex constrains from NMR titration and solvent accessibility. The program used the structure of SH3 and the SH3 bound structure of Linker for calculations.
▶ Pharmacophore screening of PTK6 inhibitor
The screening of PTK6 inhibitor based on the autoinhibition mechanism was performed using SID/Linker complex stmcture. The screening resulted in 16 hits which were validated by fluorescence experiments and kinase assay. The validation experiments reported two final candidates which had a strong affinity to PTK6 and improved the autoinhibition activity of PTK6.
4. Expectations
: We expect that the new anti -cancer drug for breast cancer will be developed based on our resultd and the academic interest on the autoinhibition mechanism of PTK6 will be increased.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 4
• 목차 ... 6
• I. 연구개발결과 요약문 ... 8
• 요약문 ... 8
• Summary ... 9
• II. 연구개발과제 연구결과 ... 10
• 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
• 2. 연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 16
• 3. 연구개발과제의 연구개발결과 ... 20
• 4. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 47
• 5. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 52
• 6. 연구개발과제의 활용계획 ... 73
• 7. 참고문헌 ... 74
• 8. 첨부서류 ... 75
• 자체평가의견서 ... 77
• 최종연구개발결과보고서 비공개 승인요청서 ... 82
• 끝페이지 ... 84