초록 ▼

본 연구에서는 주요 작물인 벼를 대상으로, ABP$_{57}$ 유전자를 분리하고, 대장균 등의 재조합 유전자 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 대량 생산 정제하고자 하였다. 정제된 단백질을 이용하여 rABP$_{57}$(recombinant ABP$_{57}$) 의 생화학적 특성을 검정하여 rABP$_{57}$의 기능이 이전 연구에서 본 연구팀이 규명한 ABP$_{57}$의 기능과 같다는 것을 확인하는 한편 재조합 유전자를 모델

본 연구에서는 주요 작물인 벼를 대상으로, ABP$_{57}$ 유전자를 분리하고, 대장균 등의 재조합 유전자 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 대량 생산 정제하고자 하였다. 정제된 단백질을 이용하여 rABP$_{57}$(recombinant ABP$_{57}$) 의 생화학적 특성을 검정하여 rABP$_{57}$의 기능이 이전 연구에서 본 연구팀이 규명한 ABP$_{57}$의 기능과 같다는 것을 확인하는 한편 재조합 유전자를 모델 식물인 벼에 도입하여 과발현 시키거나 내재 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환 식물체를 확보하여 형질전환 식물체의 농업적 특성을 관찰함으로써 ABP$_{57}$의 생리적 기능을 규명하고자 하였다. ABP$_{57}$ 유전자를 클로닝하기 위해서는 관련 유전자 서열 또는 단백질의 아미노산 서열 등 정보의 확보가 필수적이다. 본 연구팀이 최초로 규명한 ABP$_{57}$은 기존에 알려져 있지 않은 신규 단백질로서 활용이 가능한 정보가 전혀 없는 상태이므로 우선 단백질을 벼 조직으로부터 대량 정제하여 단백질의 아미노산 서열을 분석하였고 이를 바탕으로 ABP$_{57}$을 암호화하는 것으로 생각되는 유전자 염기서열을 확보하였다. PCR로 유전자를 증폭한 후 대장균, 효모, 곤충세포 등 다양한 재조합 단백질 생산 시스템에 넣어 단백질을 생산하였고 이를 이용하여 세포막 H$^+$-ATPase활성화 기능을 확인하고자 하였다. 한편 ABP$_{57}$ cDNA를 이용하여 벼 형질전환을 시도하여 과발현 개체와 RNAi 도입 개체를 다수 확보한 후 세대 진전과 선발마커인 제초제저항성 유전자를 이용한 순계 후대계통 선발을 시도하여 T2 순계 계통을 확보하였다. 후대 계통을 격리포장에서 재배하면서 길이생장, 분얼 등 형태적 특성을 관찰하였다.

Abstract ▼

Indole-3-acetic acid is the major form of auxin hormone which functions to regulate various physiological process of plants such as tissue growth, differentiation, fruit enlargement etc. In our previous research, a 57kD souluble protein(ABP57) from rice roots and shoots was found to mediate IAA effe

Indole-3-acetic acid is the major form of auxin hormone which functions to regulate various physiological process of plants such as tissue growth, differentiation, fruit enlargement etc. In our previous research, a 57kD souluble protein(ABP57) from rice roots and shoots was found to mediate IAA effect on the plasma membrane H$^+$-A TPase(proton pump) activation. Based on such observation, primary objectives of this project were set out to clone a gene encoding ABP57, to uncover the mechanism of the proton pump activation and to dig up important agronomical traits regulated by ABP57. After the purification of ABP57 from rice ethiolated shoots, amino acid sequences of four peptide fragments of it were analyzed by using a MALDI-TOP-MS/MS. Through Blast search, a gene encoding the protein was identified and cloned by PCR amplification. It was also found that there are four genes homologous in rice genome to the gene encoding ABP57. Several different host systems were taken to produce recombinant ABP57 protein such as bacteria, yeast, insect cell and plant leaves. In bacterial system, untagged and most of tagged genes encoding ABP57 produced the recombinant proteins in inclusion body. It was failed to solubilize the protein from the inclusion body. Only one case of success to obtain soluble form of the protein was achieved by expressing abp57 gene fused to maltose binding protein gene although the amount of the recombinant protein was minimal but sufficient to test for the ABP57 activity such as p-type H$^+$-ATPase activation and IAA binding. The recombinant protein activated the H$^+$-ATPase indicating that the gene cloned encodes ABP57. However the recombinant protein did not mediate the IAA effect to activate the H$^+$-ATPase. IAA binding assay revealed that the recombinant protein binds IAA only at its low affinity binding site. To obtain the recombinant protein similar to natural form of ABP57, several eukaryotic expression systems were utilized such as yeast, insect cell culture and plant (N. benthamia). However, the expression level of the recombinant abp57 were minimal. Currently, work is being done to improve the plant system for the transient expression of recombinant genes.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 10
• CONTENTS ... 12
• 목차 ... 13
• 제1장 서 론 ... 14
• 제1절 연구의 필요성 ... 14
• 제2절 연구개발의 목적 ... 15
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 16
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 17
• 제1절 ABP57 유전자 클로닝 및 서열분석 ... 17
• 1. 실험방법 ... 17
• 2. 결과 및 고찰 ... 19
• 제2절 ABP57 재조합단백질의 발현 ... 25
• 1. 실험방법 ... 25
• 2. 결과 및 고찰 ... 28
• 제3절 재조합 ABP57의 정제 및 생화학적 특성 검정 ... 32
• 1. 실험방법 ... 32
• 2. 결과 및 고찰 ... 33
• 제4절 ABP57과 IAA 결합의 생화학적 특성 규명 ... 38
• 1. 실험방법 ... 38
• 2. 결과 및 고찰 ... 39
• 제5절 ABP57 유전자 벼 형질전환 및 형질전환체 특성 검정 ... 42
• 1. 실험방법 ... 42
• 2. 결과 및 고찰 ... 44
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 48
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 51
• 제6장 참고문헌 ... 52