초록 ▼

1. 소장 상피세포 흡수촉진 유도 펩타이드 및 장기 표적형 펩타이드 탐색과 경구용 단백질 약물 전달 시스템 개발 및 응용
장점막에서 효율적으로 흡수촉진 되는 펩타이드 작용기 (Enterocyte-transcytotic peptide ligand) 및 기관 특이적 결합 펩타이드 작용기 (Organ homing peptide ligand)를 새롭게 고안된 경구 파지 디스플레이 기술(Peroral phage display technique)을 이용해 탐색하는 연구를 수행하였으며, 동정된 펩타이드의 장상피세포 흡수효율 및 기관 특이성

1. 소장 상피세포 흡수촉진 유도 펩타이드 및 장기 표적형 펩타이드 탐색과 경구용 단백질 약물 전달 시스템 개발 및 응용
장점막에서 효율적으로 흡수촉진 되는 펩타이드 작용기 (Enterocyte-transcytotic peptide ligand) 및 기관 특이적 결합 펩타이드 작용기 (Organ homing peptide ligand)를 새롭게 고안된 경구 파지 디스플레이 기술(Peroral phage display technique)을 이용해 탐색하는 연구를 수행하였으며, 동정된 펩타이드의 장상피세포 흡수효율 및 기관 특이성 효율을 실험적으로 검정하고 최종 선발된 펩타이드 작용기를 모델 단백질 약물인 인간 성장호르몬 (hGH) 유전자에 유전자 재조합 기법으로 도입한 후 미생물을 숙주로 하는 단백질 대량 발현 벡터 시스템을 구축함으로써 향 후 산업적 응용의 기초를 마련하였다.
1) 경구 파지 디스플레이 기법의 확립
- Ph.D.-C7C random phage library를 통한 control in vitro phage display
Phage titration 및 amplification 조건 확립
- Phage DNA extraction 및 automatic sequencing
- Random peptide amino acids 서열 확인
- Phage library를 통한 control in vivo phage display system 구축
- Phage library를 통한 peroral in vivo phage display system 확립
2) 소장 상피세포 내 tanscytosis 유도 및 organ homing peptides의 서열 동정 및 선발
- Liver, lung, kidney 및 spleen을 통한 peroral in vivo phage display 실시
- 장기별 phage elution samples을 amplification 후 pooling하여 biopanning 수행
- 4대 장기별 200여개의 DNA sequence 및 amino acids 서열 확보
- 총 850여개의 최종 서열 중 alignment를 통한 consensus 양상 분석
- Peptide homology 분석을 통한 transcytotic candidate peptides 및 organ homing candidate peptides 선발3) 선발된 peptides의 transcytosis 및 물질운송 효율 검정과 조직 특이성 규명
- 선발된 CSKSSDYQC, CQPAPGKQC 및 CTADQQRQC peptide의 소장 점막조직에 대한 ex vivo binding affinity검정
- 각 peptide에 대한 free ligand 합성 후 competitive binding assay 수행
- 소장 통과효율 검정을 위한 in vivo tracking assay 실시
- 후보 peptide 발현 phage 및 free peptide ligand oral administration을 통해 소장 조직에 대한 Immunohistochemistry (IHC) assay 확립
- Fluorescent dye 및 enzymatic DAB staining을 통한 IHC 수행 및 결과 분석

Abstract ▼

Rapid development of applied biotechnology research In current pharmaceutical drug industry facilitated identification of large groups of proteins having a potential to be available as drugs, which resulted in the development and commercialization of increasing number of novel macro-molecular biolog

Rapid development of applied biotechnology research In current pharmaceutical drug industry facilitated identification of large groups of proteins having a potential to be available as drugs, which resulted in the development and commercialization of increasing number of novel macro-molecular biological therapeutics, such as so called 'bio-drugs'. As the world market of these biological protein drugs is forecasted to grow to approximately 100 billion US dollars in 2010, tremendous efforts by numerous investigators have been focussing the development of more improved bio-drugs (Data Monitor USA, 2002).
Oral administration is one of the most convenient and acceptable ways for internal use of therapeutic compounds. However, conventional administration of macromolecular therapeutics should generally rely on parenteral injection because their absorption in gastrointestinal tract is mostly obstructed by enzymatic degradation and physicalbarrier function of intestinal epithelia (Fasano, 1998; Daugherty and Mrsny, 1999). Although encapsulation of such macromolecular therapeutics with synthetic polymers in particulate dosage forms mightprotect them from the acidic or enzymatic attack in gastrointestinal tract, efficient absorption of the drug across the intestinal mucosal barrier is still a challenging problem (Okada et aI., 1995; Chen and Langer, 1998).

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...3
• 요약문 ...5
• SUMMARY ...17
• CONTENTS ...23
• 목차 ...31
• 제 1 장 서론 ...39
• 제 1 절 연구개발의 목적 ...39
• 제 2 절 연구개발의 필요성 ...39
• 제 2 장 국내.외 기술개발 현황 ...43
• 제 1 절 국내 기술개발 현황 ...43
• 제 2 절 국외 기술개발 현황 ...43
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ...47
• 제 1 절 과제별 연구개발의 목표 및 내용 ...47
• 제 2 절 소장 상피세포 흡수촉진 유도 펩타이드 및 장기 표적형 펩타이드 탐색과 경구용 단백질 약물 전달 시스템 개발 및 응용 ...53
• 1. 서론 ...53
• 2. 경구 파지 디스플레이 기법의 확립 ...53
• 1) 재료 및 방법 ...53
• (1) In vitro phage display (control biopanning 1) ...53
• (2) In vivo phage display (control biopanning 2) ...58
• (3) Peroral phage display 기법 확립 및 pilot peroral biopanning ...60
• 2) 결과 및 고찰 ...63
• 3. 소장 상피세포 내 tanscytosis 유도 및 organ homing peptides의 서열 동정 및 선발 ...71
• 1) 재료 및 방법 ...71
• (1) Peroral phage display를 이용한 biopanning ...71
• (2) Phage DNA 추출 및 peptide 서열동정 ...72
• (3) 동정된 서열의 motifs 분석을 통한 transcytosis 유도 peptides 선발 ...74
• 2) 결과 및 고찰 ...74
• 4. 선발된 peptides의 transcytosis 및 물질운송 효율 검정과 조직 특이성 규명 ...82
• 1) 재료 및 방법 ...82
• (1) Ex-vivo phage binding assay 및 free ligand competition assay ...82
• (2) Transcytotic phage 추적을 위한 in vivo tracking assay ...83
• (3) Immunohistochemical assay ...84
• 2) 결과 및 고찰 ...86
• 5. 추가 선발된 펩타이드 서열의 조직특이성 및 물질운송효율 검정 ...93
• 1) 재료 및 방법 ...93
• (1) 후보 transcytotic peptides의 소장 점막층 ex-vivo binding affinity 검정 ...93
• (2) Transcytotic peptides의 free ligand competition assay ...96
• (3) 후보 organ-homing peptides의 장기별 ex-vivo binding affinity 검정 ...97
• (4) Organ-homing activity를 검정하기 위한 tail-vein injection binding analysis ...100
• 2) 결과 및 고찰 ...101
• 6. 경구용 약물 단백질 생산 유전자군 및 발현 벡터 시스템의 구축 ...111
• 1) 재료 및 방법 ...111
• (1) E.col를 이용한 경구용 단백질 약물 발현 시스템 구축 ...111
• (2) 유산균을 이용한 경구용 단백질 약물 발현 벡터 시스템 구축 ...114
• (3) 효모를 이용한 경구용 단백질 약물 대량 발현 벡터 시스템 구축 ...116
• 2) 결과 및 고찰 ...118
• 제 3 절 고불자 담지 기술 이용 단백질 약물 경구투약 시스템 개발 및 생체내 영상기법 이용 소장 트랜스사이토시스 및 조직 특이적 결합여부 검증 ...127
• 1. 서론 ...127
• 2. 고분자 담지기술을 이용한 경구투약시스템의 개발과 생체내 영상기법의 최적화 ...127
• 1) 재료 및 방법 ...127
• (1) 키토산에 티올기를 도입하여 점막점착성이 증가된 미립자를 제조하여 모델 단백질인 bovine growth hormone의 방출제어실험 ...127
• (2) 장내체류가 긴 경구용 단백질약물/백신전달시스템을 구축 ...129
• 2) 결과 및 고찰 ...131
• 제 4 절 경제적 고효율 유산균 발현벡터 시스템의 개발 ...151
• 1. 서론 ...151
• 2. 인공 zinc-finger library 구축 및 고능력 인공전사인자의 검색 ...153
• 1) 재료 및 방법 ...153
• (1) 유산균 벡터용 프로모터 선별 및 확보 ...153
• 2) 결과 및 고찰 ...156
• 3. 유산균 벡터용 고능력 인공아연전사인자의 개발 및 고효율 분비신호 펩타이드의 선발 ...164
• 1) 재료 및 방법 ...164
• (1) "ZFT plasmid library" 구축 완료 ...164
• (2) Screening of "ZFT plasmid library" with reporter plasmids ...164
• 2) 결과 및 고찰 ...165
• 4. 인공아연 전사인자의 기능 확인 및 검증과 유산균 vector system 구축 ...174
• 1) 재료 및 방법 ...174
• (1) 제조된 plasmid의 확인 및 발현 검정 ...174
• 2) 결과 및 고찰 ...175
• 제 5 절 M세포 및 수지상 세포 모델 이용 백신 전달 펩타이드 탐색과 경구용 백신 전달 시스템 개발 및 응용 ...185
• 1. 서론 ...185
• 2. M cell에 특이적으로 결합하는 cell 특이적 peptide의 연구 ...185
• 1) 재료 및 방법 ...185
• (1) In vitro phage transcytosis assay ...186
• (2) 선발된 펩타이드 서열의 트랜스사이토시스 효율 및 조직특이성 분석 ...190
• 2) 결과 및 고찰 ...193
• 3. 수지상 세포의 항원표적, 인지능력 및 사이토카인 발현 반응측정 ...199
• 1) 재료 및 방법 ...199
• (1) 말초혈액에서 미성숙 수지상세포의 분리 ...200
• (2) 미성숙 수지상세포의 LAT에 대한 반응 연구 ...200
• 2) 결과 및 고찰 ...201
• 4. M cell targeting peptide를 도입한 모델항원의 유산균 내 발현 벡터 구축 ...205
• 1) 재료 및 방법 ...205
• (1) E.coli system용 발현 벡터 구축 ...205
• (2) 유산균용 발현 벡터 구축 ...208
• 2) 결과 및 고찰 ...210
• 5. Human lymphoma에 특이적으로 결합하는 cell 특이적 peptide의 연구 ...214
• 1) 재료 및 방법 ...214
• (1) Phage display library에서 In vitro상의 필요 peptide의 검출 ...214
• (2) Selected peptide 효율 검정 ...215
• (3) Binding counterpart molecule의 추출 ...216
• 2) 결과 및 고찰 ...218
• 6. 쉬갤라와 수지상 세포의 반응기작의 연구를 통한 pathogens host 간의 상호작용 규명 ...222
• 1) 재료 및 방법 ...223
• (1) 쉬갤라의 infection 이 후에 인산화된 ERK의 변화 확인 ...223
• (2) OspF의 transfection 으로 인한 세포내 인산화된 ERK의 변화 확인 ...224
• (3) 쉬겔라의 infection으로 인한 미성숙 수지상세포의 성숙도와 싸이토카인의 분비, apoptosis의 유도 변화 ...225
• 2) 결과 및 고찰 ...226
• 제 6 절 유용 단백질 약물 생산 유전자 gene bank 구축 및 효모/유산균 숙주 이용 재조합 단백질 최적 생산 시스템 확립 ...237
• 1. 서론 ...237
• 2. 단백질 약물/백신의 전달체로 사용하기 위한 환경친화적인 효모균주의 개발 ...238
• 1) 재료 및 방법 ...238
• (1) AOX1 promoter하에서 발현하는 cytosolic DT A gene construct 제작 ...238
• (2) Constitutive하게 발현하는 모델 단백질약물의 유전자 제작 ...239
• (3) 제작된 유전자를 영양소 감수성 효모로 형질전환 및 단백질 발현 ...239
• (4) 메탄올의 2차 대사산물과 배지 성분에 따른 영양소 감수성 균주의 사멸 ...239
• (5) Oxgall의 존재유무에 따른 경구투여용 효모의 성장 속도 및 단백질의 발현여부 확인 ...239
• (6) YPD, YPM, MD, MM배지에서 JW501 균주의 성장곡선 측정 ...240
• (7) 분비형 DTA 유전자의 제작 및 형질전환 그리고 형질전환체 선별 ...240
• (8) DTA의 단백질 발현 및 정제 ...241
• (9) Saporin 유전자의 제작 및 형질전환 그리고 형질전환체 선별 ...242
• 2) 결과 및 고찰 ...242
• 3. 소장에서 흡수전달능력이 향상된 성장호르몬 (hGH-dFc)의 개발 ...252
• 1) 재료 및 방법 ...252
• (1) T -84 cell line의 배양 및 Transwell assay ...252
• (2) 모델 약물단백질의 농도 측정을 위한 ELISA assay ...253
• (3) Gene construction ...254
• (4) 재조합 약물 단백질을 생산하는 형질전환 효모의 선별 ...256
• (5) 효모로부터 생산된 재조합 약물단백질의 정제 ...257
• (6) Gel filtration HPLC에 의한 모델 약물단백질의 분자량 측정 및 환원제 처리에 의한 분자량 변화의 측정 ...258
• (7) 환원조건과 비환원 조건하에서의 SDS-PAGE9f Western blotting ...258
• (8) 모델 약물단백질의 기능 최적화 ...259
• 2) 결과 및 고찰 ...260
• 제 7 절 분자설계기법을 이용한 조직 특이적 결합 펩타이드의 설계 ...283
• 1. 서론 ...283
• 2. 조직 특이적 수용체 데이터베이스 구축 ...283
• 1) 재료 및 방법 ...283
• (1) 사람 조직의 mRNA 유전자 발현 프로파일 데이터베이스 ...285
• (2) 막 횡단 영역 예측 프로그램 ...286
• 2) 결과 및 고찰 ...288
• 3. 소장상피조직 모델 구축 ...290
• 1) 재료 및 방법 ...290
• (1) 전사인자 Cdx-2의 클로닝과 발현벡터 구축 ...290
• (2) 전사인자 Cdx-2 의 IEC 6 세포내의 발현을 통한 enterocyte culture system 구축 ...292
• 2) 결과 및 고찰 ...293
• 4. 트랜스사이토시스 유도 펩타이드 분석을 위한 데이터베이스 구축 - 공통 서열의 색인화 ...294
• 1) 재료 및 방법 ...294
• (1) 펩타이드 명명의 체계화 ...294
• (2) 다중 서열 정렬 (Multiple Sequence Alignment) ...295
• (3) 그룹화 (Clustering) ...296
• (4) 공통 서열(Consensus Sequence)의 탐색 ...299
• (5) Scoring Function의 도입 ...301
• 2) 결과 및 고찰 ...302
• 5. 조직 특이적 수용체 후보 서열의 신호 펩타이드 영역 예측 ...305
• 1) 재료 및 방법 ...305
• (1) 신호 펩타이드 예측 프로그램 (signalP 3.0) ...306
• (2) 막 횡단 수용체 후보 서열 예측 ...307
• 2) 결과 및 고찰 ...308
• 6. 조직 특이적 수용체 후보 서열의 3차원 구조 예측 및 데이터베이스 구축 ...310
• 1) 재료 및 방법 ...310
• (1) 조직 특이적 수용체 후보 선정 ...310
• (2) 조직 특이적 막 횡단 수용체 후보 서열들의 3차원 구조 예측 ...311
• 2) 결과 및 고찰 ...312
• 7. 수용체-펩타이드 작용기의 3차원적 결합 메커니즘 규명 ...318
• 1) 재료 및 방법 ...318
• (1) 3차원 가상 라이브러리 구축 ...318
• (2) Phannacophore 기반의 가상 탐색 ...320
• (3) 수용체 구조에 기반을 둔 분자 도킹 ...321
• 2) 결과 및 고찰 ...321
• 8. 소장조직 유래의 cDNA가 삽입된 T7 박테리오파지 cDNA 라이브러리의 구축 및 수용체 탐색 ...326
• 1) 재료 및 방법 ...326
• (1) T7 박테리오파지 cDNA expression library 구축 ...326
• (2) 소장 Transcytotic ligand 인 CSKSSDYQC 에대한 receptor 탐색 ...327
• 2) 결과 및 고찰 ...328
• 9. Rat 소장상피세포주 IEC-6 cell line 과 전사인자 Cdx-2를 이용한 entercyte culuture system의 구축 ...331
• 1) 재료 및 방법 ...331
• (1) 전사인자 Cdx-2 의 IEC 6 세포내의 발현을 통한 enterocyte culture system 구축 ...332
• 2) 결과 및 고찰 ...333
• 10. Web-based solution 구축과 서비스 ...335
• 1) 재료 및 방법 ...335
• (1) 서열 분석 방법의 자동화 시스템 구축 ...335
• (2) Web-based solution 구축 및 서비스 ...338
• 2) 결과 및 고찰 ...340
• 11. 조직 특이적인 펩타이드 작용기에 대한 탐색 및 DB 구축 ...345
• 1) 재료 및 방법 ...345
• (1) 다중 서열 정렬 기법을 기용한 조직 특이적 펩타이드 작용기 탐색 ...346
• (2) 데이터베이스 검색 기법을 이용한 조직 특이적 펩타이드 작용기 탐색 ...346
• (3) 조직 특이적 펩타이드 작용기의 선정 ...347
• 2) 결과 및 고찰 ...347
• 12. 조직 특이적인 펩타이드 작용기에 대한 생물학적 의미 탐색 ...348
• 1) 재료 및 방법 ...348
• (1) QPAPGKQ의 생물학적 의미 탐색 ...349
• (2) QPAPGKQ의 구조적인 의미 탐색 ...349
• 2) 결과 및 고찰 ...349
• 13. 수용체-펩타이드 작용기의 결합 모드 분석 ...351
• 1) 재료 및 방법 ...351
• (1) Cyclic 펩타이드의 안정된 3차원 구조 예측 방법 개발 ...351
• (2) 선발된 M 세포 표적 펩타이드 작용기와 수용체 후보 단백질((Ganglioside GM1)과의 결합 모드 분석 ...351
• 2) 결과 및 고찰 ...353
• 14. 기계학습법을 이용한 펩타이드 작용기의 소장 통과 여부 예측 프로그램 개발 ...358
• 1) 재료 및 방법 ...358
• (1) 펩타이드 서열의 수집 (Data set 생성) ...358
• (2) 표현자 (Descriptor) ...359
• (3) 기계학습 모델 생성 (Machine Learning Model) ...360
• (4) 평가 ...361
• (5) 검증 ...361
• 2) 결과 및 고찰 ...361
• 15. 소장 통과 펩타이드 작용기의 생물학적 의미 탐색 ...368
• 1) 재료 및 방법 ...368
• (1) Fisher의 직접확률법 (Fisher's exact test) ...368
• (2) 소장 통과 펩타이드 서열의 수집 ...368
• (3) 임의의 펩타이드 표본 획득 ...368
• (4) 서열 유사성에 근거한 펩타이드 그룹화 ...368
• (5) 그룹화된 펩타이드 서열 집단에 대한 통계 분석 ...369
• (6) 서열 유사성에 근거한 펩타이드 그룹화를 이용한 결합 모티프의 일바화 ...370
• 2) 결과 및 고찰 ...370
• 16. 소장 통과 펩타이드 작용기의 생물학적 의미 탐색 ...374
• 1) 재료 및 방법 ...374
• 2) 결과 및 고찰 ...374
• (1) NPASSQL의 생물학적 의미 탐색 ...374
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 연구성과 ...377
• 제 1 절 연구개발목표의 달성도 ...377
• 제 2 절 정량적 연구성과 ...378
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ...389
• 제 1 절 연구결과 활용계획 ...389
• 제 2 절 추가 연구의 필요성 ...393
• 제 6 장 기타 중요 변도사항 ...395
• 제 1 절 협동과제 책임자 변경 ...395
• 제 7 장 참고문헌 ...397