[보고서]임상적으로 중요한 항생제 내성인자 단백질 작용 기작 규명을 통한 억제제 발굴 기반 연구

진형종

임상적으로 중요한 항생제 내성인자 단백질 작용 기작 규명을 통한 억제제 발굴 기반 연구
Action mechanism of clinically important antibiotic resistance factor protein will tell how we can develop peptide, RNA and classical chemical inhibitors 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	수원대학교 The University of SuWon
연구책임자	진형종
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2011-09
과제시작연도	2010
주관부처	교육과학기술부
사업 관리 기관	한국연구재단
등록번호	TRKO201200003321
과제고유번호	1345122147
DB 구축일자	2013-04-18
키워드	항생제 내성,억제제,단백질-RNA 상호작용antibiotic resistance,inhibitor,protein-RNA,interaction,Erm,methylation

초록 ▼

1. Erm의 억제제 창출은 MLSB 항생제 내성을 극복하는데 매우 중요함
2. 이를 위해 최소기질, 활성화부위, 완전기질과 이와 유사한 활성의 기질 확보
3. 위의 다양한 기질을 이용, 단백질-RNA 상호작용 확립 (상호작용 아미노산과 nucleotide의 규정, cooperative interaction등의 long ranged interaction의 확립)
4. Methylation기작에 근거, 반응 단계를 기질인식, binding for methylation, methylation, conformational change for release로 나누고 각 단계에 작용하는 RNA 또는 protein 부위 규명
5. Phylogenetic analysis와 작용양식이 다른 새로운 Erm의 발굴을 통하여 보다 많은 Erm에 작용할 수 있는 억제제 창출기반 마련과 KsgA와의 상관관계규정으로 독성예견 가능성 확보
6. 8,000여종의 화합물과 400여종의 repositioning 화합물을 검색, 약 6종의 hit을 확보함

Abstract ▼

There are more than 30 Erm proteins which causes the highest and the most problematic antibiotic resistance to all MLSB antibiotics. Thus, to develop the inhibitors of this protein family, besides elucidating the reaction mechanism of this enzyme, phylogenetic analysis of Erm proteins including KsgA to define the relationship among members, investigation of the disparity in action mechanism among members and screening of the chemical library including drugs for repositioning was carried out. 6 hit compounds obtained through the screening will be modified based on the findings through this research project.

목차 Contents

제출문 ... 1
보고서요약서 ... 2
요약문 ... 3
SUMMARY ... 5
목차 ... 9
제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 10
1. 연구개발의 필요성 및 목적 ... 10
2. 연구개발의 범위 ... 13
제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 15
( 1 ) 국내 , 외의 기술개발 현황 ... 15
( 2 ) 본 연구결과의 기술개발현황에서의 위치 ... 15
제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 17
( 1 ) 활성화 부위 아미노산의 역할 정량화 ... 17
( 2 ) ErmSF의 최소 기질 분석과 core motif 확립 ... 23
( 3 ) 최소기질을 포함한 substrate RNA에서 활성에 중요한 nucleotide의 역할 규명 및 역할 정량화 ... 25
( 4 ) Stem 73 bulge 구조와 nucleotide의 기질 활성에서의 의미 ... 39
( 5 ) 역할이 확인된 nucleotide의 완전기질; domain V (DV)로의 적용 ... 46
( 6 ) Assay system의 확립 ... 49
( 7 ) 확립된 assay system을 이용한 억제제의 선별 ... 51
( 8 ) 병원성 내성균주 이용한 억제제 후보물질 검색 ... 53
( 9 ) Drug Repositioning ... 55
( 10 ) 비 병원성 유래의 낮은 활성의 Erm을 이용한'methylation level과 항생제 내성간의 correlation'에 대한 특성 분석과 이의 억제제 선별에로의 적용 ... 57
( 11 ) Erm paralogue인 KsgA의 phylogenesis ... 69
( 12 ) Erm phylogenesis의 확립 ... 70
제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 83
( 1 ) 연구개발의 최종목표 ... 87
( 2 ) 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 88
제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 93
1. 추가연구의 필요성 ... 93
2. 타연구에의 응용 ... 93
3. 기업화 추진 방향 ... 93
제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 94
제 7 장 참고문헌 ... 96

표/그림 (61)

표 A variety of substrates which be used in this study
표 Ribbon representation of the ErmC' structure.
표 The proposed methylatable adenine binding pocket
표 S64A, C, G, F, T, Y mutagenesis. A Purification. B CD spectra. C In vivo assay. D Activity assay
표 Q65E, N, R, H mutagenesis. A Purification. B CD spectra. C In vivo assay. D Activity assay
표 F67A, H, L, W, Y mutagenesis. A Purification. B CD spectra. C In vivo assay. D Activity assay
표 Activity test of 60RRE62 motif truncated ErmSF.
표 Antibiotic susceptibility assay of NTTEs. a erythromycin b lincomycin
표 MIC test of NT59TE and its mutants (erythromycin)
표 (a) Expression of ErmSF and various N-teminal end truncated ErmSF proteins in E. coli. (b) SDS-PAGE of wild type ErmSF and various N-terminal end region truncated ErmSF proteins
표 (a) Expression of N-teminal end 1-59 amino acid truncated ErmSF (NT59TE) mutant protein and its substitution mutant proteins (NT59TE R60A, NT59TE R61A and NT59 RR60, 61AA) in E. coli. (b) SDS-PAGE of NT59TE and its substitution mutant proteins.
표 a, Methylatable adenine과 cofactor인 SAM이 binding하는 ‘Binding pocket’을 둘러싸고 있는 motif. b, 219RREFRPVPRVDS230motif에 존재하는 F222 mutant들의 항생제 감수성 검사
표 a, R223A, R227Amutant의 항생제 감수성 검사. b, R223A, R227Amutant의 in vitro methylation test.
표 Sbustrate activity test. Truncated stem73 and stem74 RNA.
표 Minimal substrates with different activity or structure.
표 Two different tetra loop (UUCG, GCAA) minimal substrates.
표 a. Competition analysis of NTER1-49 and 1-39 peptide with 22nt RNA, b. Wild type and munat RNAs which in stem 73 distant from methylatable adenine A2085, c. Competition analysis of NTER1-39 or -49, d. NTER1-49, 39 binding site
표 NT59TE overexpression and purification and Activity test of wild type & NT59TE to DV, 72, i72 and 66nt RNAs
표 Kd analysis of wild type and NT59TE to 72, i72 and 66nt RNAs
표 DV와 stem 73, 74로 구성된 72nt 그리고 NTED binding site를 mutation한 i72nt, 66nt에 대한 Kd 및 kinetic parameter 분석
표 이 실험에서 사용한 666nt 23S rRNA domain V의 schematic 2차 구조와 box 안에 표현한 것은 72nt RNA의 2차구조
표 a는 72, i72, 66nt RNA의 RNase V1을 이용한 2차 구조 분석 및 ErmSF의 footprinting, b는 RNase A를 이용한 2차 구조 분석 및 ErmSF의 footprinting, c는 lead와 nuclease S1을 이용한 2차 구조 분석.
표 Secondary structure model of the 41nt RNA, i41nt RNA, and 35nt RNA as predicted by the RNA draw software.
표 Kinetic parameter and Kd analysis of domain V (DV), 41nt, i41nt and 35nt RNAs
표 Secondary structure determination of 41, i41 and 35nt RNAs
표 (a) RNAs containing mutations in bulge of stem 73 and (b) their substrate activities. (c) Kd values of mutant RNAs.
표 Huge increase in substrate activity by introducing bulge at the position three base pairs away from the methylatable adenine.
표 66nt RNA의 stem 73에 존재하는 bulge A2051를 U로 치환하거나 (A2015U) deletion한 (A2051-) mutant RNA의 a) 시간에 따른 활성 분석과, b) kinetic parameter 분석
표 An edge of the 66nt GC base pair mutated RNA activity.
표 Secondary structure probing of 66, 64nt RNA with computer program RNAdraw and RNase U2, T1, S1 and V1.
표 66nt, 64nt RNA Kinetic parameter & Kd analysis
표 ErmSF footprinting analysis of 66nt or 64nt.
표 Stem 73 한쪽 single strand를 포함한 single strand RNA에 대한 methylation 활성과 binding 기작 분석.
표 A Secondary Structure Diagram of the Peptidyl Transferase Loop and a Loop from Domain II of 23S rRNA Along with the Sequence Numbers of Nucleotides.
표 Structure of stem73 bulge mutant DV RNAs.
표 Kinetic assay of stem73 bulge mutant DV RNAs.
표 Kinetic assay of stem 74 base pair mutant RNAs.
표 Wild type DV & 2069G:C2442 base pair inversion mutant DV DMS footprinting analysis
표 여러 Erm gene의 AS19(DE3)와 AS19 2plasmid에서의 leaky한 발현확인(SDS PAGE) lane1.
표 E. coli AS19에서 DE3 lysogen과 2 Plasmid system에서의 Em에 대한 MIC
표 Screening시에 각 Erm gene에 의한 Em의 cell inhibition 정도 control
표 Screening을 통하여 선정된 억제제 후보 화합물
표 Screening을 통하여 선정된 후보물질의 파생물에서 검색된 억제제 후보 물질
표 실험에 사용된 S. aureus 균주의 erythromycin 농도에 따른 16시간 incubation한 O.D 그래프
표 병원균을 이용한 screening system을 이용한 화합물에서의 억제제 후보물질 검색
표 E. coli screening system을 이용한 drug repositioning 검색을 통해 얻어진 drug list
표 병원균 screening system을 이용한 drug repositioning 검색을 통해 얻어진 drug list.
표 Schematic representation of ErmK expression plasmid (pMK301) under the control of ermC regulatory region (attenuator)
표 B. subtilis BR151 strain에서 각 construct들의 항생제 감수성 검사
표 MICs (㎍/㎖) of antibiotics against B. subtilis BR151 carrying constructed plasmids
표 각기 erm gene으로 구성된 plasmid를 지닌 B. subtilis BR151 strain의 성장 곡선
표 (a) SDS-PAGE를 이용한 total cell lysate에서의 ErmK의 발현확인. (b) Antibiotic susceptibility assay with E. coli cells with ermC, ermK, ermN and harboring empty pET23b.
표 (a) Large subunit ribosomal RNA of E. coli and Secondary structure of the peptidyltransferase region within domain V of E. coli 23S rRNA. (b) Autoradiograph of reverse transcripts of in vivo-methylated 23S rRNA
$(a) Expression and purification of soluble recombinant ErmK. ErmK band is indicated by arrow. Lane 1, total cell proteins; lane 2, inclusion body fraction; lane 3, supernatant fraction of lysate; lane 4, affinity run-through; lane 5, 1 × binding buffer column wash; lane 6, 100 mM imidazole column wash; lane 7, purified soluble ErmK protein. (b) ErmC와 ErmK의 in vitro methylation assay$ 표 (a) Expression and purification of soluble recombinant ErmK. ErmK band is indicated by arrow. Lane 1, total cell proteins; lane 2, inclusion body fraction; lane 3, supernatant fraction of lysate; lane 4, affinity run-through; lane 5, 1 × binding buffer column wash; lane 6, 100 mM imidazole column wash; lane 7, purified soluble ErmK protein. (b) ErmC와 ErmK의 in vitro methylation assay
표 In vitro methylation of 72nt RNA substrate
표 ErmC’과 ErmK의 발현과 각기 solubility를 나타내는 SDS-PAGE
표 KsgA, Dim 단백질군의 Maximum likehood와 Bayesian method를 사용하여 작성한 phylogenetic tree.
표 Unrooted trees constructed by Bayesian inference (A) and maximum likelihood (B) methods
표 A Bayesian rooted tree with posterior probabilities and ML bootstrap values.
표 A Bayesian tree inferred from an alignment of 250 amino acid positions from 70 bacterial KsgAs. Posterior probability and ML bootstrap value (100 replicates) are given at branching points.
표 A Bayesian tree inferred from an alignment of 250 amino acid positions from 111 Erm methylases.Posterior probability and ML bootstrap value (100 replicates) are given at each branching point.

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