보고서 정보
주관연구기관 |
식품의약품안전평가원 |
연구책임자 |
김은정
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참여연구자 |
정호상
,
안준익
,
김선화
,
전설희
,
송현모
,
이광현
,
안수미
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2010-12 |
과제시작연도 |
2010 |
주관부처 |
식품의약품안전청 |
과제관리전문기관 |
식품의약품안전평가원 National Institute of Food and Drug Safety Evaluation |
등록번호 |
TRKO201200006700 |
과제고유번호 |
1475005604 |
DB 구축일자 |
2013-05-20
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키워드 |
간독성,전사체,내인성대사체,생체지표,랫드 일차배양간세포,사람 일차배양간세포liver toxicity,endogenous metabolites,biomarker,rat primary hepatocytes,human primary hepatocytes
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초록
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본 연구는 랫드 일차 배양 간세포를 이용한 25종 간독성 유발물질 및 사람 일차 배양 간세포를 이용한 5종 간독성 유발물질에 대해 전사체 및 대사체 기술을 이용하여 각 약물의 전사체 및 대사체 프로파일을 확보하고, 생물정보학적 및 통합적 분석 등을 통해 독성 유발물질의 간독성 기전에 따른 포괄적 유전자 네트워크의 구성과 더불어 간독성 예측지표를 발굴하고자하였다.
약물 간독성을 야기한다고 알려져 있는 acetaminophen을 포함하는 25종의 약물을 랫드 간세포에 처리하고 24시간 후 각각 전사체 및 대사체 프로파일을 확보하였
본 연구는 랫드 일차 배양 간세포를 이용한 25종 간독성 유발물질 및 사람 일차 배양 간세포를 이용한 5종 간독성 유발물질에 대해 전사체 및 대사체 기술을 이용하여 각 약물의 전사체 및 대사체 프로파일을 확보하고, 생물정보학적 및 통합적 분석 등을 통해 독성 유발물질의 간독성 기전에 따른 포괄적 유전자 네트워크의 구성과 더불어 간독성 예측지표를 발굴하고자하였다.
약물 간독성을 야기한다고 알려져 있는 acetaminophen을 포함하는 25종의 약물을 랫드 간세포에 처리하고 24시간 후 각각 전사체 및 대사체 프로파일을 확보하였다. LDH assay 등 다수의 in vitro assay를 이용해 25종 간독성약물 중 5종은 necrosis에 의해, 20종은 apoptosis에 의해 세포 독성이 발생함을 알 수 있었다. 확보된 전사체 프로파일로부터 25종 약물간의 발현 차이가 나는 유전자를 얻기 위해 ANOVA 분석을 시행하고 최종 5,732개의 유전자를 확보하였다. 5,732개 유전자의 발현 양상은 25종의 약물을 크게 3개의 군으로 나누었으며, 각 군에 집중되어 있는 신호 경로 및 각 군에 특이적인 경로 (pathway)를 경로 분석을 통해 얻을 수 있었다. 확보된 대사체 프로파일로부터 global profiling 및 Metlin DB를 이용하여 25가지 targeted metabolite를 도출하였다. 경로 분석 결과, aminoacyl-tRNA biosynthesis, glutathione metabolism pathway가 집중되어 있는 것이 전사체 결과와 일치하였고, palmitic acid, arginine, oleic acid, leucine/isoleucine, lysine이 간독성 예측인자(predictor)로 도출되었다. 그리고 전사체 프로파일과 용역연구로부터 도출된 단백체 프로파일의 통합 분석을 통해 간독성약물반응으로 MAPK, regulation of actin cytoskeleton, cell cycle, RNA processing 관련 유전자들이 집중적으로 발현 변화되는 pathway임을 밝혔고, 최종 21종의 간독성 후보지표를 제시하였다.
랫드 간세포에 처리한 약물 중 chlorpromazine 등의 5종을 동일한 방법으로 인간 일차배양 간세포에 처리하고 전사체 및 대사체 프로파일을 확보하였다. 확보된 전사체 프로파일로부터 ANOVA분석을 통해 395개의 유의발현유전자를 도출하였다. 이들 유의발현유전자에 집중되어 있는 pathway는 MAPK, mevalonate pathway, ubiquitin-mediated preteolysis, cell proliferation, cell cycle, steroid biosynthesis이였다. 약물 5종에 의해 사람과 랫드에서 유의하게 발현 변화되는 유전자를 비교해 본 결과, 공통된 유전자는 16개이었으나, 각 유전자의 발현 패턴은 두 종간에 서로 상이하게 나타났다. 그리고 확보된 대사체 프로파일로부터 약물 5종에 의해 유의하게 발현 변화되는 것으로 예측되는 2-keto-n-heptylic acid 등과 같은 지방산 대사체를 최종 도출하였다.
본 연구결과는 신약개발 및 허가과정에서 보다 신속 정확한 의약품 안전성 평가에 활용될 수 있을 것이며, 또한 독성유발물질의 간독성 기전에 따른 포괄적인 유전자 네트워크의 구성에 기반 자료로도 활용될 수 있을 것이다.
Abstract
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This study examined transcriptomic and metabolomic expression for hepatotoxicity by an in vitro both rat primary hepatocytes and human primary hepatocytes. Rat and human hepatocytes were exposed for 24h to 25 drugs and 5 drugs, respectively, with different mechanisms of hepatotoxicity, at inhibition
This study examined transcriptomic and metabolomic expression for hepatotoxicity by an in vitro both rat primary hepatocytes and human primary hepatocytes. Rat and human hepatocytes were exposed for 24h to 25 drugs and 5 drugs, respectively, with different mechanisms of hepatotoxicity, at inhibition concentration 20(IC20), i.e. ranitidine.
To identify differentially expressed genes among 25 drugs, ANOVA analysis was performed. This analysis revealed that 5,732 genes showed differential expression among drugs. In hierarchical clustering analysis using 5,732 genes, 25 drugs were clustered into 3 groups. The pathway enriched in each group and the pathway that are specific to each group were also identified. Global profiling using PLS-DA analysis and identification of endogenous metabolites using Metlin DB was investigated. As a result, 25 targeted metabolites was obtained. Several potential metabolic pathway using KEGG were obtained, of which aminoacyl-tRNA biosynthesis and glutathione metabolism were corresponded with transcriptomic data. Futhermore, targeted profiling revealed that palmitic acid, arginine, oleic acid, leucine/isoleucine, lysine were obtained as predictors for hepatotoxicity. The integrative analysis of gene and protein expression changes altered by hepatotoxicants revealed 4 distinct pathways including MAPK, regulation of actin cytoskeleton, cell cycle, as well as RNA processing pathway and 21 putative hepatotoxic biomarker.
Transcriptomic and metabolic profiles were also obtained from 5 hepatotoxicant (i.e. chlorpromazine, ranitidine, trazodone, ticlopidine, valproic acid)-treated human hepatocytes. 395 genes were identified as differentially expressed genes by ANOVA analysis. The pathway analysis revealed that MAPK, mevalonate pathway, ubiquitin-mediated preteolysis, cell proliferation, cell cycle and steroid biosynthesis pathway were enriched in these altered genes. Comparative analysis of human and rat transcriptomic data were shown that the number of common gene was 16 genes between human and rat DEGs, but expression pattern of each gene between two species was different. The metabolic analysis was also observed that fatty acid (i.e.2-keto-n-heptylic acid) metabolites were differentially expressed.
These results might provide better understanding of the biological mechanisms underlined beneath drug-induced hepatotoxicity and might be used in accurate and fast safety evaluation of drugs.
목차 Contents
- 자체연구개발과제 최종보고서 ... 1
- 표지 ... 2
- 요약문 ... 4
- Summary ... 5
- 목차 ... 6
- I. 연구개발과제 연구결과 ... 7
- 제1장 연구개발과제의 개요 ... 7
- 제2장 연구개발과제의 국내.외 연구개발 현황 ... 11
- 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 17
- 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 29
- 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 154
- 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획 ... 155
- 제7장 참고문헌 ... 157
- 제8장 첨부서류 ... 158
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