보고서 정보
주관연구기관 |
연세대학교 산학협력단 |
연구책임자 |
이진우
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2012-05 |
과제시작연도 |
2011 |
주관부처 |
교육과학기술부 |
사업 관리 기관 |
한국연구재단 |
등록번호 |
TRKO201200007374 |
과제고유번호 |
1345162496 |
사업명 |
21세기프론티어연구개발 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
중간엽 줄기세포.관절 연골 결손.연골 비후.화학주성.Mesenchymal stem cell.Osteochondral defect.Chondrocyte hypertrophy.Chemotaxis.
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초록
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성인 골수 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 관절 연골 결손의 치료 및 기반기술을 확보하고자함. 다음의 4 가지 세부 목표를 정하여 연구를 추진하였음.
1) 노화 세포군의 재활성화 (repopulation) 배양법
중간엽 줄기세포의 제한된 증식능력으로 실험의 제한을 해결하기 위한 재활성화 세포 배양법을 개발하였으며 기존의 세포 배양법에 비해 월등히 나은 증식력과 분화력을 관찰하였음. 노화된 중간엽 줄기세포의 재활성화에 따라 stemness에 관여하는 Sox2와 Nanog, 그리고 골분화 유전자인 Runx2와 Dlx5가 중간
성인 골수 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 관절 연골 결손의 치료 및 기반기술을 확보하고자함. 다음의 4 가지 세부 목표를 정하여 연구를 추진하였음.
1) 노화 세포군의 재활성화 (repopulation) 배양법
중간엽 줄기세포의 제한된 증식능력으로 실험의 제한을 해결하기 위한 재활성화 세포 배양법을 개발하였으며 기존의 세포 배양법에 비해 월등히 나은 증식력과 분화력을 관찰하였음. 노화된 중간엽 줄기세포의 재활성화에 따라 stemness에 관여하는 Sox2와 Nanog, 그리고 골분화 유전자인 Runx2와 Dlx5가 중간엽 줄기세포의 노화/lineage commitment 과정에 중요할 것으로 생각하여 이 유전자들에 대한 기능적 실험을 수행하였음. 노화가 진행중인 중간엽 줄기세포는 다른 lineage로의 분화 능력은 감소되지만 골분화 능력만은 유지하게 됨. 노화과정동안 골분화 관련 유전자가 증가되고 줄기성 관련 유전자가 감소되면서 떨어지는 중간엽 줄기세포의 능력이 감소되는 것과 상관성이 있는 것으로 확인됨.
2) 골화 최소화 순수 연골 분화법
in vitro에서 연골 분화법은 연골의 분화 유도뿐만 아니라, 골아세포의 분화가 함께 유도됨. 연골세포 분화 동안 골분화가 최소화 되고 연골분화가 최대화되는 분화법을 찾기위해 M7A7 alginate bead, micromass, CFU 법 등을 사용하여 유전자 발현을 분석함. cbfa1, Sox6, Sox9, Type Ⅱ collagen, Type Ⅹ collagen 유전자 발현을 토대로 하여 micromass 배양 방법이 더 효율적인 연골분화법임을 확인하였음. 또한 연골세포 분화과정동안 비후 관련 유전자들의 억제를 위해, 연골세포 비후 관련 유전자에 관여하는 microRNA를 스크리닝하였으며 그 결과 중간엽 줄기세포의 연골분화를 조절하는 LEF-1의 발현을 억제시키는 miR-449a을 발굴하였음.
3) STAT에 의한 연골 및 지방세포 분화기전
지방세포 분화기간동안 STAT5A와 STAT5B발현이 증가하였으며, C/EBPα와 C/EBPβ에 의해 STAT5B의 전사활성이 조절되는 것을 관찰하였음. PPARγ에 의해 STAT5A의 전사활성이 조절되었으며, STAT5A가 억제되면 지방세포로의 분화가 억제되었음. 사람의 골수유래중간엽 줄기세포의 골분화기간 동안에 전체 STATs의 발현을 확인하였음. STAT5A를 억제시켰을 경우 골분화 표지자인 DLX5와 Runx2의 발현과 골분화능이 향상되었으며, STAT5B를 억제 시켰을 때에는 골분화에 영향을 주지 않았으며, DLX5가 STAT5A promotor에 결합하여 STAT5A 전사활성을 약 20배이상 증가시켰음. 즉, STAT5A의 억제와 과발현을 통해 골분화 관련 유전자와 관계를 가짐을 확인하였음.
4) 관절 연골 결손의 치료를 위한 골-연골 복합 지지체 개발
중간엽 줄기세포에서 발현하고 관절연골 손상이 증가하는 chemokine과 그 수용체를 스크리닝하였음. 발굴된 MCP-1, MIP-3α, IL-8, SDF-1의 주화성과 세포증식, 분화에 관한 영향을 관찰한 결과, 세포 증식 및 분화에는 영향을 주지 않으며 세포이동을 촉진하였음.
in vivo에서 살펴본 결과, 이식된 IL-8과 MIP-3α를 함유한 지지체를 향해 중간엽 줄기세포가 유의하게 이동하는 것을 확인하였음. 조직학적 분석결과, 화학주성인자를 함유한 지지체내로 유입된 세포가 주입된 사람의 골수 유래 중간엽 줄기세포임을 검증하였다. 또한 화학주성에 의해 모여든 사람의 중간엽 줄기세포에 의해 주변 피하조직의 형성이 촉진되었음을 확인하였으며, 염증반응은 확인되지 않았다. 또한 골관절염 중대형 동물모델에서 IL-8과 MIP-3α를 함유한 골-연골 지지체가 이식된 군에서 초기에 연골재생이 대조군에 비해 촉진되는 것을 확인하였음.
Abstract
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Mesenchymal stem cells (MSCs) are a kind of adult stem cells and mainly existed in the bone marrow. They are known to multipotent cells which can differentiate into bone, cartilage, muscle, and fat. We tried to develop following four generic or application technologies for the regeneration of articu
Mesenchymal stem cells (MSCs) are a kind of adult stem cells and mainly existed in the bone marrow. They are known to multipotent cells which can differentiate into bone, cartilage, muscle, and fat. We tried to develop following four generic or application technologies for the regeneration of articular cartilage using bone marrow derived MSCs.
1) The reactivation technique of aged MSCs on senescence by in vitro culture.
In this study, gene expression of Sox2 and Nanog was decreased with increasing passage, whereas Dlx5 expression was increased. Also, over-expression studies of Dlx5 gene showed significant decrease in mRNA expression of Sox2, a stemness marker, and Nanog in MSCs. It is thought that Dlx5 reduce stemness of MSCs through suppression of Sox2 or Nanog. Thus, Dlx5 may be important to study the aging of MSC by in vitro expansion.
2) Advanced technique for chondrogenic differentiation of MSCs to minimize osteogenic genes.
We identified the increasing pattern of LEF-1 during chondrogenic differentiation of MSCs. also we showed miR-449a to significantly inhibit LEF-1 expression. In addition, we confirmed the binding site of miR-449a to LEF-1 using luciferase reporter assay using LEF-1 3’-untranslated region and mutated seed sequence of miR-449a. In western blot analysis, LEF-1 was inhibited when miR-449a was over-expressed and was seen to be recovered when miR-449a was inhibited. Our study reveals for the first time the novel function of miR-449a in regulation of chondrogenesis via direct targeting of LEF-1.
3) The mechanism and application technique of STAT gene for chondrogenic and adipogenic differentiation of MSCs.
The expression of STAT5A and STAT5B increases with the onset of adipogenesis in MSCs. The PPAR response elements regulatory element of STAT5A exists at a promoter region ranging from -346 to -101, and the CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) regulatory element is located at -196 to -118 of the STAT5B promoter. C/EBPb and C/EBPa bound to the STAT5B promoter region, whereas peroxisome proliferatoractivated receptor g (PPARg) bound to STAT5A. RNA interference of STAT5A completely blocked adipogenic differentiation, whereas the inhibition of STAT5B only partially blocked differentiation. We propose that C/EBPa, C/EBPb, and PPARg control adipogenesis by regulating STAT5B and STAT5A and that STAT5A is necessary, whereas STAT5B plays a supplementary role during adipogenesis. Further, the regulation of PPARg-STAT5 by C/EBPb signaling seems to be the crucial adipogenesis pathway-initiating cascade of the various adipogenic genes. In addition, the expression of STAT5A and STAT5B increased time dependently during osteogenesis. Inhibition of STAT5A expression markedly enhanced osteogenic differentiation. Also, we presented that DLX5 regulated the transcriptional activity of STAT5A. Collectively, these data indicate that STAT5A acts as a pivotal transcription factor in osteogenesis and adipogenesis of MSCs.
4) Development of the osteochondral composite scaffold for articular cartilage regeneration
CCR2, CCR4, CCR6, CXCR1, and CXCR2 were expressed in MSCs and increased significantly upon treatment with pro-inflammatory cytokines. The migration was increased by MIP-3α and IL-8 more than that by MCP-1 or SDF-1α. IL-8 and MIP-3α significantly enhanced the chemotaxis of MSCs compared to MCP-1, SDF-1α and control. In nude mice, the in situ recruitment of MSCs toward transplanted either IL-8 or MIP-3α with scaffolds was significantly induced.
According to the results of histological analysis, fibroblastic cells recruited into chemokines-containing scaffolds were identified as MSCs which were injected into tail vein of mice. In addition, the subcutaneous tissue formation was enhanced by recruited MSCs without inflammatory reaction. Therefore, this study suggests that IL-8 and MIP-3α are candidates for regeneration of damaged articular cartilage.
목차 Contents
- 제출문 ... 1
- 보고서 요약서 ... 2
- 요약문 ... 4
- SUMMARY ... 7
- CONTENTS ... 9
- 목차 ... 10
- 제1장 연구개발과제의 개요 ... 11
- 1. 연구개발의 필요성 ... 11
- 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 13
- 1. 성인 골수 유래 고분화율 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 기술 ... 13
- 2. 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포의 연골 및 지방세포 분화 기전 ... 14
- 3. 관절연골 결손 치료를 위한 조직공학 기술 ... 14
- 4. 현기술상태의 취약성 ... 16
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 17
- 1. 노화 세포군의 재활성화 배양법 ... 17
- 2. FAK에 의한 중간엽 줄기세포의 분화기전 ... 34
- 3. 중간엽 줄기세포의 Chemotaxis receptor의 발현 분석 ... 35
- 4. STAT에 의한 연골 및 지방세포 분화기전 ... 44
- 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 63
- 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 64
- 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 64
- 제7장 연구시설ㆍ장비 현황 ... 64
- 제8장 참고문헌 ... 65
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