[보고서]정원줄기세포를 이용한 세포치료 기반 기술 확립

류범용

정원줄기세포를 이용한 세포치료 기반 기술 확립 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	중앙대학교 산학협력단
연구책임자	류범용
참여연구자	김병각 , 이용안 , 김방진 , 김기중 , 김용희
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2012-05
과제시작연도	2011
주관부처	교육과학기술부
사업 관리 기관	한국연구재단
등록번호	TRKO201200007390
과제고유번호	1345162512
사업명	21세기프론티어연구개발
DB 구축일자	2013-04-18
키워드	정원줄기세포.다분화능.자가증식.세포치료.정원줄기세포이식.Spermatogonialstemcells.multipotency.self-renewal.celltherapy.spermatogonialtransplantation.

초록 ▼

● 정원줄기세포 특이적 마커을 이용한 순수도 증진, 정원줄기세포의 대량생산 체계 및 serum/feeder free 배양기법를 확립함
●생쥐 다분화능 정원줄기세포의 생산 및 배양기법을 확립하고, 생체내 이식 및 분자생물학적 기법을 통하여 분화능을 검증함
●정원줄기세포의 장기간 보존을 위하여 동결보존제를 발굴하여 효율적인 동결보존법을 개발함
●인간 다분화능 정원줄기세포 생산기술을 확립하고, 분자생물학적 기법을 이용하여 다분화능 마커 유전자의 단백발현을 확인함
●인간 다분화능 정원줄기세포의 feeder free 배양기법, 조직특이적 분화기술을 확립하였음
●생쥐 다분화능 정원줄기세포를 대상으로 signaling molecule 및 조직 특이적 유전자도입 기술을 이용하여 신경세포 및 심근세포 특이적 분화기법을 확립함
●다분화능 정원줄기세포부터 분화된 세포를 대상으로 심근전구세포 마커와 FACS기법을 적용하여 심근세포로의 분화가능한 세포군의 대량확보기술을 확립함
●랫트를 대상으로 심근경색 질환모델동물을 생산 하였으며, 다분화능 정원줄기세포로 부터 분화된 심근전구세포를 모델동물에 이식 후 이식된 세포의 생착 및 기능성을 확인하였음.

Abstract ▼

The derivation of autologous pluripotent stem cells and establishment of tissue specific differentiation could be final goal in translational stem cell research. Here, we develop the neuronal and cardiac specific differentiation from pluripotent germ-line stem cells. The spermatogonial stem cells(SSCs) were purified by spermatogonial stem cell markers and they cultivated successfully using serum and/or feeder free conditions with specific growth factors. Under these conditions, SSCs were cultivated for the long time and reconstituted the spermatogenesis after transplantation into recipient testis. For the long-term storage of the SSCs, we cyropreserved the SSCs using trehalose as the cryoprotectant. Also we established the pluripotent germ-line stem cells both mouse and human. These ES-like cells expressed the pluripotent stem cell markers such as Oct4, Sox2 and nanog. And these pluripotent germ-line stem cells successfully differentiated into various cell types when injected into immune-deficient mouse model and in vitro suspension culture condition. After that, we develop the tissue specific differentiation technique using signaling molecules and tissue specific gene transduction. And we purified cardiac precursor cells using PDGFRa which is marker for the cardiac and vascular precursor cells. The sorted cardiac precursor cells were transplanted into myocardial infarction model, PDGFRa positive cells improved cardiac function, as determined by measurement of fibrosis areas. Futhermore, we could demonstrated that transplanted cells expressed cardiomyocyte markers using immunohistochemistry. Our results of the last 4 years could be important applications for germ-line stem cell biology and opens the possibility of using these technique for biotechnology and regenerative medicine without ethical issues.

목차 Contents

제 출 문 ... 1
요 약 문 ... 3
SUMMARY ... 10
CONTENTS ... 11
목 차 ... 11
제1장 연구개발과제의 개요 ... 12
1절. 연구개발의 필요성, 목표 및 내용 ... 12
제2장 국내외 기술개발 현황 ... 17
1) 랫트모델에서 연령별 정소내 정원줄기세포의 회수, 농도 조사 및 이식 기법개발 ... 19
2) 랫트 정원줄기세포의 특이 항원을 규명하고 이를 이용한 정원줄기세포의 고순도 분리 기술을 개발 ... 20
3) 무혈청배양액을 이용한 랫트 정원줄기세포의 장기간 체외 배양 기법 개발 ... 20
4) 정원줄기세포의 자가증식 기능에 aging과 niche microenvironment가 미치는 영향 조사 ... 21
5) 정원줄기세포에 유전자 도입 및 이식기법을 이용한 형질전환 동물의 생산 ... 23
6) Microarray를 이용한 정원줄기세포 및 분화단계의 생식세포에서 특이 발현 유전자 조사 및 기능 분석 ... 25
7) 정원줄기세포 자가증식 기전 규명과 증식 조절 기술 개발을 위한 선행 연구 결과 ... 26
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 29
1차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 29
2차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 33
3차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 44
4차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 50
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 59
제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 63
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 63
제7장 연구시설ㆍ장비 현황 ... 63
제8장 참고문헌 ... 64

표/그림 (54)

표 정원줄기세포의 이식 및 분석 기법 모식도.
표 Rat에 있어서 연령별 정소내 정원줄기세포의 농도 및 활성도 분석.
표 랫트 recipient 모델개발.
표 FA CS 기법을 이용한 rat 정원줄기세포에서 발현되는특이 항원 검증.
표 10개월 이상 장기간 배양된 랫트 정원줄기세포에서 GDNF의 수용체 발현양상.
표 순수분리된 랫트 정원줄기세포를 GDNF, GFR α1, bFGF가 첨가된 무혈청배 양액과 공배양 세포를 이용하여 체외배양증식.
표 GFP 유전자를 발현하는 형질전환 생쥐의 정소에서 채취된 정원줄기세포를 젊은 recipient의 정소에 이식하고 약 3개월 가량 배양한 후 recipient의 정소로부터 이식되어졌던 정원줄기세포를 회수하여 또 다른 젊은 recipient의 정소에 재이식하는 과정을 반복하면서 8 차례 약 962일 간의 정원줄기세포의 활성도 및 수적인분석 결과.
표 그림 7에서와 같은 방법으로 40 개월간 9 회 재이식 과정을 처친 정원줄기세포의 활성도 분석.
표 랜티바이러스 벡터를 이용한 정원줄기세포에 유전자 도입 효율.
표 랫트 정원줄기세포와 이식기법을 이용한 형질전환 동물생산 모식도.
표 정원줄기세포의 활성도와 유전자 발현 조사를 위하여 각기 다른 생리학적인 상태의 생쥐 정소 세포를 사용함.
표 정원줄기세포의 농도가 높은 cryptorchid (정소내 정원줄기 세포의 농도가 높음)에서 상대적으로 과발현 되었던 유전자 리스트
표 체외배양 과정중 자가증식 정원줄기세포에서 RET (c-Ret proto-oncogen)과 NCAM의 발현양상
표 각각의 antibody inhibition 처리에 따른 자가증식 정원줄시세포의 증식양상.
표 각기 다른 생리학적인 상태의 생쥐 정소에서 quantitative real-time PCR analysis를 이용한 GDNF and GFRa1의 발현양상 조사.
표 5개월간 체외배양된 정원줄기세포의 생체 이식을 통한 기능적 활성도 분석.
표 성장단계에 따라 채취된 정원줄기세포의 기능적 활성도 및 체외배양 양상.
표 Feeder free 조건에서의 정원줄기세포의 배양양상.
표 다분화능 정원줄기세포의 생산을 위한 배양 조건에서 정원줄기세포의 배양 양상.
표 Trehalose와 DMSO의 복합처리로 동결/융해된 정원줄기세포의 생체 이식을 통한 기능적 활성도 분석.
표 각 세포군간의 형태학적 비교.
표 RT-PCR을 통한 다분화능 정원줄기세포에서 pluripotent 마커 유전자의 발현 양상.
표 다분화능 정원줄기세포의 ALP 활성 검사
표 면역세포화학법을 통한 다분화능 정원줄기세포에서pluripotent 마커 유전자의 단백발현 양상.
표 면역세포화학법을 통한 정원줄기세포와 다분화능 정원줄기세포에서 Oct4 발현양상. 동일조건으로 실시되어진 면역세포화법 결과 Oct4의 발현수준이 다분화능 정원줄기세포에서 정원줄기세포 보다 높게 나타남이 확인 됨. 200X
표 다분화능 정원줄기세포의 테라토마 형성능력 확인.
표 다분화능 정원줄기세포로부터 형성된 테라토마의 조직학 표본.
표 다분화능 생쥐 정원줄기세포로부터 분화유도 된 신경전구세포의 nestin 발현 양상.
표 세포외기질물질을 이용하여 순수도가 증진된 정원줄기세포의 양상.
표 이종간 정소내 이식 기법을 통한 인간 정원줄기세포의 기능적 활성도 분석.
표 다분화능 인간 정원줄기세포의 생산을 위한 배양조건에서 인간 정원줄기세포의 증식 양상
표 RT-PCR 기법을 이용한 인간 정원줄기세포의 pluripotent 마커 유전자 발현 양상.
표 A), B), C): Oct4 발현양상. D), E), F): Nanog 발현양상. A), D): DAPI. B), E): green fluorescence. C), F):merge. 다분화능 인간 정원줄기세포에서 다분화능 특이적 유전자가 발현함.
표 Feeder free 조건에서의 정원줄기세포의 배양 양상.gelatin 또는 laminin 이 피복된 배양접시에서 1주일간 배양한 결과 colony의 형태 및 크기는 공배양 처리와 비교 하였을때 차이가 나지 않았음.
표 인간 다분화능 정원줄기세포세포로부터 형성 유도된 배아체 양상. A) 부유배양을 통해 형성된 배아체. 100X.B) A)의 확대사진. 200X
표 A), B), C): NF 발현양상. D), E), F): MAP2 발현양상. G), H), I): GFAP 발현양상. A), D), G): Hochest. B),E), H): green fluorescence. C), F), I): merge. 신경세포군으로 분화유도된 세포들로부터 신경세포군 특이적 유전자가발현함. 400X
표 배아체형성 및 DMSO처리를 이용한 심근세포군의 분화유도 후 박동하는 심근세포군의 배양양상.
표 A), B), C): muscle actin 발현양상. A): hochest.B): green fluorescence. C): merge. 심근세포군으로 분화유도된 세포들에서 muscle actin 유전자가 발현함. 400X
표 A), B), C): NF 발현양상. D), E), F): MAP2 발현양상. G), H), I): GFAP 발현양상. A), D), G): hochest. B),E), H): green fluorescence. C), F), I): merge. SHH를 이용하여 신경세포군으로 분화유도된 세포들로부터 신경세포군특이적 유전자가 발현함
표 A), B), C): NF 발현양상. D), E), F): MAP2 발현양상. G), H), I): GFAP 발현양상. A), D), G): hochest. B),E), H): green fluorescence. C), F), I): merge. SHH 와FGF8의 병행처리하여 신경세포군으로 분화유도된 세포들로부터 신경세포군 특이적 유전자가 발현함
표 Ngn1 유전자가 도입된 다분화능 정원줄기세포의 배양양상.
표 A), B), C): nestin 발현양상. A): hochest. B): green fluorescence. C): merge. 인간 다분화능 정원줄기세포로부터 분화된 세포들에서 신경전구세포 특이적 마커의 발현.400X
표 A), B), C): NF 발현양상. D), E), F): MAP2 발현양상. G), H), I): GFAP 발현양상. A), D), G): hochest. B),E), H): green fluorescence. C), F), I): merge.
표 각각의 성장인자 농도별로 3일간 분화유도 후brachyury의 발현양상
표 BMP4(50ng/ml) 처리를 통하여 분화유도된 다분화능 정원줄기세포에서의 분화과정 중 심근세포 특이적 유전자의 발현양상
표 인간다분화능 정원줄기세포와 각 성장인자를 이용하여 5일간 분화 후 MESP1의 발현양상
표 PDGFRa 유전자 발현 세포의 분리 및 심근분화능 검증 A) PDGFRa 항체 및 FACS기법을 이용한 세포의 분리. B) 분리된 세포의 2일간 부유배양 후 배아체 형성양상.C) 면역세포화학법을 이용한 cTnT 발현양상.
표 다분화능 정원줄기세포로부터 분화된 심근세포이식을 위한 심근경색 질환모델동물의 생산
표 좌전하행동맥 결찰에 의한 심근경색이 유도 된 랫트로 부터 적출된 심장.
표 H&E 및 MT staining을 이용한 심장조직염색을 통한 심근경색증 유발검증 A, B) H&E staining. C ,D) MT staining. A, C) 좌전하행동맥을 결찰을 실시하지 않은 대조군 심장. B, D) 좌전하행동맥 결찰 2주후 적출된 심장
표 H&E 및 MT staining을 이용한 심장조직염색을 통한 이식된 세포의 조직 재생능 검증 A, B) H&E staining.C,D) MT staining. A, C) 좌전하행동맥을 결찰 4주후 적출된 대조군 심장. B, D) 좌전하행동맥 결찰과 함께 PDGFRa를 발현하는 세포군의 이식 4주후 적출된 심장. 화살표: 세포이식 부위
표 MT staining을 이용한 심장조직염색을 통한 이식된 세포의 조직 재생능 검증. control: 심근경색 유도 4주후 적출된 심장의 섬유화 정도. transplanted: 심근경색 유도와 함께 다분화능정원줄기세포로부터 분화된 심근 전구세포이식 4주후 적출된 심장의 섬유화 정도
표 세포이식 후 면역조직화학법을 이용한 muscle actin 유전자의 발현검증. MI: Myocardial infarction(심근경색)
표 세포이식 후 면역조직화학법을 이용한 cTnT 유전자의 발현검증

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