초록 ▼

빠르게 증식하는 간세포암은 성장에 필요한 에너지와 물질을 얻기 위해 hexokinase II가 과발현된다. 한편, 간세포암은 간동맥에서 대부분의 혈류공급을 받으므로 간동맥으로 항암 물질을 주입하는 것이 항암 효과를 극대화하고 전신 부작용을 줄이는 방법이다. 따라서, hexokinase II 억제제의 간동맥/문맥 주입이 우리나라 암 사망의 주요 원인인 간암에 대한 새로운 치료 전략이 될 가능성이 있으나 전세계적으로 아직 개념 정립의 초기단계로 3-bromopyruvate(3-BP)의 hexokinase II 억제기전, 암세포 사멸기전

빠르게 증식하는 간세포암은 성장에 필요한 에너지와 물질을 얻기 위해 hexokinase II가 과발현된다. 한편, 간세포암은 간동맥에서 대부분의 혈류공급을 받으므로 간동맥으로 항암 물질을 주입하는 것이 항암 효과를 극대화하고 전신 부작용을 줄이는 방법이다. 따라서, hexokinase II 억제제의 간동맥/문맥 주입이 우리나라 암 사망의 주요 원인인 간암에 대한 새로운 치료 전략이 될 가능성이 있으나 전세계적으로 아직 개념 정립의 초기단계로 3-bromopyruvate(3-BP)의 hexokinase II 억제기전, 암세포 사멸기전, 저산소증과의 연관성, 정상세포와 개체에 미치는 영향이 명확히 밝혀져 있지 않으며 그 항암 효과가 기존의 치료법과 비교해서 어떤 장단점이 있는지 규명되지 않았다. 본 연구의 목표는 간세포암에서 hexokinase II 억제제의 항암 효과 및 안전성을 in vitro 및 in vivo에서 증명하고, 그 작용 기전과 항암 효과를 극대화시키는 최적조건을 규명하여 이를 임상적으로 적용할 수 있는 기초 자료로 제공하는 것이다.
본 연구의 결과 간세포암은 저산소 상태에서 암세포 성장이 더욱 가속화되는데, HIF-1α를 경유한 hexokinase II 단백의 발현 증가와 adrenomedullin(AM)과 carbonic anhydrase-IX(CA-IX)의 mRNA 및 단백 수준의 발현 증가 등이 암 진행의 주요한 분자 기전으로 확인되었다. 사람 간암 세포주 및 생쥐 간암 모델에서 hexokinase II 억제제인 3-BP의 주 항암 기전이 세포 괴사가 아닌 mitochondrial apototic signaling pathway를 경유하는 세포 자멸사가 임을 증명하였고, 그 구체적 기전으로 3-BP가 hexokinase II와 VDAC의 결합을 해제하여 PTPC의 개방을 유도하고 이어서 세포 자멸사 단백인 cytochrome c를 세포질내로 유출시킴으로써 암세포의 자멸사를 유도함을 증명하였다. 생쥐간암 모델에서 3-BP 투여 후 역동적으로 세포 자멸사를 정량화할 수 있는 분자 영상법
(99m Tc-HYNIC Annexin V scan)을 통해 종양이 완전히 소실되기 전 상태에서 치료 반응여부를 평가할 수 있었다.
mRNA microarray 기법을 통하여 저산소 환경의 간세포암 세포주에서 mRNA 발현이 증가된다고 확인된 AM과 CA-IX에 대하여 각각의 억제제를 처리하였을 때 간세포암의 성장이 억제되고 자멸사가 촉진됨을 in vitro에서 확인하였다. 아울러 이들의 억제제를 3-BP와 함께 간세포암 세포주에 처리하였을 때 이러한 성장 억제와 자멸사 촉진 효과가 더욱 향상됨을 관찰하였다. 본 연구에서는 AM과 CA-IX이라는, 저산소 환경에서 간세포암의 자멸사를 억제하는 새로운 단백을 규명하였고 이의 억제제와 3-BP 양제 병합 요법의 항암 상승 효과를 in vitro 수준에서 규명하였다.
3-BP는 가토의 VX2 carcinoma cell line에 대한 in vitro 실험에서 낮은 농도(0.2 mM)에 서도 강력한 세포독성을 보였으며, VX2 carcinoma cell line과 가토의 정상 간세포에서, 3-BP는 Hexokinase II가 과발현된 악성 종양에서 통계적으로 유의하게 높은 세포독성을 보임을 밝혔다. 또한 VX2 carcinoma 간암 모델에서 3-BP의 동맥내 주입은 종양대사를 억제 시킴을 FDG-PET을 이용하여 증명하였다. 그러나, 본 연구의 in vitro와 in vivo 실험 결과 종양 세포나 조직에서 더 높은 세포독성을 보이지만 정상 간세포나 간 실질에 대하여도 농도 의존적인 세포독성, 간독성이 있음을 확인할 수 있었다. 3-BP는 5mM 이상의 농도에서 정상 간동맥으로 주입하였을 때 기존의 보고와는 달리 상당한 간독성을 유발함을 밝혔고, VX2 carcinoma 간암 모델에서 3-BP의 동맥내 주입은 농도의존적 항암효과를 보이나 기존에 임상에 사용되고 있는 치료법의 효과에 비하여 항암효능이 떨어지므로 투여방법의 적정화에 관한 연구와 동맥내 주입에 효과적인 제형의 개발이 필요성이 제기되었다.
3-BP 사용하기 부적절함이 밝혀졌다. 3-BP는 물에 아주 잘 용해되며, 물 또는 공기중의 수분과 반응하여, bromide ion이 해리되는 과정을 거쳐분해된다. Bromide 생성과정에서 proton이 생성되는데 HBr은 매우 강항 산이므로, 분해과정에서 pH가 감소하는 현상을 관찰할 수 있었다. Bromide의 해리는 proton NMR, C13 NMR 및 Volhard 법에 의한 유리 bromide를 정량하여 확인하였다. 온도 또는 용액의 pH에 따른 항암제의 분해정도는 bromide ion을 정량하여 확인하였다. 3-BP는 온도가 높을수록 또한 pH가 높을수록 빠르게 분해되며, 공기중의 수분에 의해서도 분해되었다. 수용액상에서 불안정하고, 심한 염증반응을 동반한 독성을 보이는 항암제인 3-BP의 전신적 노출을 막고, 종양만 치료하기 위해서 간동맥화학색전용 w/o emulsion 제형을 제조하였다. 수성조영제인 Iopamiro에 3-BP를 용해시키고 이를 유성조영제인 Lipiodol과 섞어서 3 시간 이상 안정한 w/o emulsion을 만들었으며, paclitaxel을 함께 봉입시킨 복합제형의 경우 안정성이 더욱 증가한 것을 관찰하였다. 3-BP를 유효성분으로 하는 간동맥색전용 emulsion은 항암제 수용액보다 독성이 적으며, 주사부위에 괴사가 일어나지 않았다.
ethyl bromopyruvate(EBP)가 3-BP의 전구체로서 hexokinase II 억제에 의한 항암효과가 있음을 밝혔다. EBP는 VX2 carcinoma cell line과 가토의 정상 간세포로 실시한 in vitro실험에서 종양세포에 대한 독성이 더 강함을 밝혔고, 농도의존적 항암효과를 보임을 증명하였다. VX2 carcinoma 간암 모델에서 EBP의 동맥내 주입은 농도의존적 항암효과를 보였으며, 고농도(40mM) 주입군에서도 심각한 간독성이 없슴을 증명하였다. EBP도 수용액상에서 ethanol이 해리되면서 3-BP로 변한다. 또한 수용액상에서 독성을 나타내며, 불안정하므로, 안정성을 증대시킬 수 있는 제형의 개발이 필요하며, 유성조영제인 Lipiodol에 잘 용해되고 안정성이 증대되는 성질이 있어서 다른 항암제(paclitaxel, doxorubicin)와의 복합제제를 만들 수 있는 여지가 있으며, 정상 간에 적은 간독성을 보여 임상에 적용될 가능성이 높은 것으로 판단되었다.

Abstract ▼

In rapidly proliferating hepatocellular carcinoma, hexokinase II is overexpressed to acquire energy and substance for its growing. Because hepatocellular carcinoma is exclusively supplied by the hepatic artery, it is safe and effective method to infuse chemotherapeutic agents via the hepatic artery.

In rapidly proliferating hepatocellular carcinoma, hexokinase II is overexpressed to acquire energy and substance for its growing. Because hepatocellular carcinoma is exclusively supplied by the hepatic artery, it is safe and effective method to infuse chemotherapeutic agents via the hepatic artery. Therefore, intraarterial/intraportal infusion of hexokinase II could be a new strategic paradigm for hepatocellular carcinoma which is one of major cancers in Korea, but is worldwide in the initial theoretical level. It is unclear the mechanism of suppression of hexokinase II by 3-bromopyruvate(3-BP), the mechanism of cancer cell death, the association between hypoxia and cencer cell death, and the effect on normal cells and individual. It is not apparent what kind of merits and faults the antitumor effects of 3-bromopyruvate have in comparison with the established chemotherapeutic agents.
The purpose of this study is in vitro and in vivo to verify the chemotherapeutic effect and safety of hexokinase II inhibitor for hepatocellular carcinoma, to search for the optimal condition to maximize its chemotherapeutic effect, and to offer the fundamental data to apply its clinical trial.
In the results of this study, the proliferation of cancer cells is accelerated in hypoxia, and overexpression of hexokinase II protein via HIF-1α and mRNA and protein of adrenomedullin(AM) and carbonic anhydrase-IX(CA-IX) is proved to be the main molecular mechanism of cencer cell proliferation. In human hepatocellular carcinoma cell lines and mouse hepatoma models, the principal antitumor mechanism of 3-BP, hexokinase II inhibitor, is verified as cancer cell apoptosis via mitochondrial apototic signaling pathway not cell necrosis, and the concrete mechanism is revealed that 3-BP release the bonding between hexokinase II and VDAC to induce the opening of PTPC, and then cause cytochrome c, cell apoptotic protein, to be outflowed in cytoplasm to induce cancer cell apoptosis. In mouse hepatoma models, the evaluation of the treatment response was possible by molecular imaging (99mTc-HYNIC Annexin V scan) which can dynamically quantify cell apoptosis after 3-BP injection before tumor mass was completely resolved.
It was verified in vitro that the proliferation of hepatocellular carcinoma was suppressed and apoptosis was accelerated, when hepatoma cell lines was treated with inhibitors of AM and CA-IX of which mRNA was proved to be overexpressed in hypoxia by mRNA microarray. In addition, when the combination of inhibitors of AM, CA-IX and 3-BP was treated in hepatoma cell lines, we observed that this suppression of cell growth and apoptosis acceleration was more induced. This project verify the new proteins, AM and CA-IX, which suppress hepatoma cell apoptosis in hypoxia condition, and the boosting antitumor effect of combination therapy of AM and CA-IX inhibitor and 3-BP at the level of in vitro.
3-BP showed in vitro strong toxicity even at low concentration(0.2mM) against VX2 carcinoma cell line of rabbit. In VX2 carcinoma cell liine and normal liver cells of rabbit, 3-BP showed statistically high cell toxicity against caner cells in which hexokinase II was overexpressed. In VX2 hepatoma models, intraarterial infusion of 3-BP was proved to suppress the metabolism of tumor cells by FDG-PET. In vitro and in vivo, however, 3-BP have cell toxicity and hepatotoxicity in normal liver cells and parenchyme in proportion to its concentration, although 3-BP have higher toxicity against tumor cells and tissues. Intraarterial infusion of 3-BP of 5mM or more was proved to cause significant hepatotoxicity, which was in discord with previous reports. Intraarterial infusion of 3-BP in VX2 carcinoma hepatoma model showed dose-dependent antitumor effect but was less effective than preexistent clinical chemotherapeutic agents. Therefore, the optimization of delivery methods and development of effective regimen was needed.
3-BP was revealed to be unstable and improper to be used in commercial. 3-BP easily dissolves in water, and is disassembled via the dissociation of bromide ion in reaction with water or vapor in air. Because proton is produced during formation of bromide and HBr is very strong acid, the decrease of pH was observed. The dissociation of bromide was quantitatively verified by proton NMR, C13 NMR and Volhard method. The degree of agent degradation according to temperature or pH of solution was verified by the quantification of bromide ion. The higher temperature or higher pH, the more rapidly 3-BP was resolved. The emulsion regimen for intraarterial chemoembolization with 3-BP which is unstable in water and cause toxicity with inflammatory reaction was developed to reduce systemic toxicity and to selectively treat tumor. The emulsion was made by resolution of 3-BP in Iopamiro and mixing with Lipiodol, which was stable over 3 hours. The complex emulsion with paclitaxel showed more improved stability. The emulsion of 3-BP had less toxicity than drug solution and did not cause skin necrosis at injection site.
Ethyl bromopyruvate(EBP), progenitor of 3-BP, was proved to have antitumor effect by inhibition of hexokinase II. EBP was verified to have more toxicity against tumor cells in VX2 carcinoma cell line and normal liver cells of rabbit, to have dose-dependent chemotherapeutic effect, and to show no significant hepatotoxity in even high dose(40mM). EBP in water is converted into 3-BP emitting ethanol. Since EBP is unstable and shows toxicity in solution, a new stable regimen is needed. EBP can be easily dissolved in Lipiodol, oil contrast agent, and enhanced in stability. EBP was thought to be promising candidate for clinical trial for hepatocellular carcinoma because of its low toxicity against normal liver and possible complex regimen with other agents such as paclitaxel and doxorubicin.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 17
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 62
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 65
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 69
• 6. 첨부서류 ... 71
• 제1세부 연구개발과제 연구결과 ... 72
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 73
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 74
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 76
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 82
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 83
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 84
• 7. 참고문헌 ... 85
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 87
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 88
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 89
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 97
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 110
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 111
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 112
• 7. 참고문헌 ... 113
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 114
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 115
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 115
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 117
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 135
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 136
• 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 137
• 7. 참고문헌 ... 137