초록 ▼

본 연구개발의 내용은 CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH) 적중벡터를 제작하여, 미니돼지의 체세포에 도입한 후, 이들 체세포를 이용하여 핵이 제거된 돼지난자에 주입하고, 재구성된 난자를 대리모에 이식하여 CMAH 유전자가 제거된 형질전환 복제돼지를 생산하는 데 있다. 이를 위하여,
1. 1년차 목표 (2009/10년)
1) 미니돼지의 체세포주 확립
2) CMAH 유전자 knock-out을 위한 염기서열 확보
3) CMAH 유전자 및 단백질에 대한 기능 연구
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본 연구개발의 내용은 CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH) 적중벡터를 제작하여, 미니돼지의 체세포에 도입한 후, 이들 체세포를 이용하여 핵이 제거된 돼지난자에 주입하고, 재구성된 난자를 대리모에 이식하여 CMAH 유전자가 제거된 형질전환 복제돼지를 생산하는 데 있다. 이를 위하여,
1. 1년차 목표 (2009/10년)
1) 미니돼지의 체세포주 확립
2) CMAH 유전자 knock-out을 위한 염기서열 확보
3) CMAH 유전자 및 단백질에 대한 기능 연구
4) CMAH 유전자 적중 벡터의 제작
2. 2년차 목표 (2010~11년)
1) 효율적인 CMAH 적중 벡터의 제작
2) CMAH 유전자가 knock-out된 체세포주의 확립
3) knock-out된 체세포주의 질적 향상을 위한 세포 배양액의 개선
4) 적중된 체세포의 염색체 이상 검증
5) CMAH 유전자가 knock-out된 복제 수정란의 생산 및 검증
6) 돼지 AO 혈액형을 유발하는 A형 및 O형 대립유전자의 차이점 분석
3. 3년차 목표 (2011~12년)
1) CMAH 유전자가 knock-out된 복제 수정란의 생산 및 이식
2) CMAH 유전자가 knock-out된 복제 미니 돼지 생산
3) 복제 미니돼지의 형질전환 검증
4) DNA 분석을 활용한 돼지의 A형 및 O형 혈액형 간편 분석법의 개발하여,
최종적으로 비알파갈 항원 결정기를 제거함으로써, 면역 거부 반응이 한층 억제된 이종장기 이식용 복제 돼지를 생산하는 것이다.

Abstract ▼

1. Establishment of germ-free mini-pig cell lines and CMAH knock-out cell lines We have established 4 mini-pig cell lines such as embryonic fiblroblast cells, mesenchymal stem cells, umbilical vein endothelial cells, and placental trophoblast cells from several tissues and organs of germ-free mini-p

1. Establishment of germ-free mini-pig cell lines and CMAH knock-out cell lines We have established 4 mini-pig cell lines such as embryonic fiblroblast cells, mesenchymal stem cells, umbilical vein endothelial cells, and placental trophoblast cells from several tissues and organs of germ-free mini-pigs. To make a transgenic donor cell lines which lack of CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH) gene, we have constructed zinc finger nuclease knock-out vector and donor DNA containing neor gene. We designed a targeting vector to disrupt on exon 8 of pig CMAH genomic gene via homologous recombination in the above cells. This vector effectively disrupted a CMAH gene and we successfully made the several CMAH knock-out cell lines after selection of G-418 antibiotic. These cells used somatic cell nuclear transfer (scNT) and embryo transfer for production of transgenic mini-pig which lack of CMAH gene. We have also used these cells in the specific lectin blot and immunofluorescence assay to detect the Neu5Gc bound glycocojugates (H-D antigen) and CMAH protein expression, respectively.
2. Production of anti pig CMAH antibody and immunoblotting We have developed several poly and monoclonal anti pig CMAH antibodies using Cor N-terminal peptide sequences originated from pig CMAH protein. The monoclonal antibody derived from N-terminal sequence have higher binding affinity than that of C-terminal. Use this C-terminal specific antibody, we analyzed the full-length (65 kda) and derivatives (42 kda & 38 kda) of CMAH protein in pig organ. The organs such as spleen and liver showed different expression levels of CMAH derivatives in Western blot. In the immunofluorescence assay, heterozygote CMAH KO cells were decreased in the expression level of CMAH protein compare with the control. This N-terminal specific antibody could be useful on the assay of scNT-derived mini-pig which lack of CMAH gene.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 7
• 제1장 서 론 ... 10
• 제1절 연구개발의 목적 ... 10
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 10
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 19
• 제1절 국내외 연구현황 비교 ... 19
• 제2절 이종이식 면역반응 분석 인프라 관련 연구개발 현황 ... 21
• 제3절 우리나라 이종장기 전반의 경쟁력 ... 22
• 제4절 필요 연구분야 ... 23
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 26
• 제1절 연구의 이론적 실험적 접근방법 ... 26
• 제2절 연구내용 및 범위 ... 26
• 제3절 연구결과 ... 33
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 72
• 제1절 목표대비 달성도 ... 72
• 제2절 정량적 성과 ... 73
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 80
• 추가연구의 필요성 ... 80
• 제6장 중요 변동사항 ... 81
• 제7장 참고문헌 ... 82
• ZFN 이용한 효율적인 CMAH KO 세포주 수립 및 AO혈액형 분석법 ... 87