초록 ▼

◦세부과제명: PEDV 중화 단클론항체 작성 및 발현연구
1. PEDV에 대하여 중화능을 나타내는 2C10 단클론항체의 363 bp의 VH 유전자, 약 325 bp의 VL 유전자 및 약 94 bp의 링커 유전자 클로닝 및 염기서열분석 확인
2. 5‘ 말단에 SfiI과 3’ 말단에 NotI 싸이트가 연장된 2C10 scFV 유전자를 증폭한 약 760 bp의 밴드 클로닝 및 염기서열분석 확인
3. 대장균에서의 발현한 2C10 scFv 단백질은 SDS-PAGE한 결과 약 30 kDa에 해당하는 분자량을 확인하였음
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◦세부과제명: PEDV 중화 단클론항체 작성 및 발현연구
1. PEDV에 대하여 중화능을 나타내는 2C10 단클론항체의 363 bp의 VH 유전자, 약 325 bp의 VL 유전자 및 약 94 bp의 링커 유전자 클로닝 및 염기서열분석 확인
2. 5‘ 말단에 SfiI과 3’ 말단에 NotI 싸이트가 연장된 2C10 scFV 유전자를 증폭한 약 760 bp의 밴드 클로닝 및 염기서열분석 확인
3. 대장균에서의 발현한 2C10 scFv 단백질은 SDS-PAGE한 결과 약 30 kDa에 해당하는 분자량을 확인하였음
4. 발현 후 정제한 native 및 denature 형태의 2C10 scFv 단백질 모두에서 2-6배의 PEDV 중화능을 확인할 수 있었음
5. 정제된 0.2 ㎎/0.5 ㎖의 2C10 scFv 단백질은 동량으로 혼합한 바이러스 즉 104 PFU/㎖를 90% 이상 중화함을 확인할 수 있었다.
◦세부과제명: PEDV 중화 단클론항체 작성 및 발현연구(계속)
6. 2C10 scFv를 대장균 표면에 발현하여 중화능의 보유여부를 확인하고자 2C10 scFv, IgA protease 유전자의 signal sequence 및 IgA protease β 도메인 유전자를 클로닝하고 2C10 scFv를 대장균 표면에 발현하기 위한 플라스미드인 pET5a sig-scFv-IgABeNE (5874 bp)를 작성하였음.
7. 작성된 pET5a sig-scFv-IgABeNE 플라스미드를 대장균(E.coli Rosseta-2)에 형질전환 및 발현하고 항 penta-Histidine 항체를 이용하여 Western bolt 분석을 실시한 결과 약 64kD의 단백질이 발현되었음을 확인할 수 있었음
8. 2C10 scFv를 표면 발현하는 대장균인 Rosetta2-2C10scFv는 PEDV에 대하여 95%이상의 중화능이 있음을 확인할 수 있었다.
9. phage display를 이용한 PEDV에 반응하는 돼지 Fab 작성연구를 위해 전략을 구성하였고 돼지 scFv 작성을 위한 13종의 primer 또는 linker를 제작하였다.
10. 돼지 IgG 항체 VH 및 VL 유전자 PCR 증폭 및 libray 작성, 염기서열 분석 확인하여 pCAN-VH-VL library를 작성하고 이를 이용한 phage display 결과 PEDV와 특이적인 scFv는 없었음
11. phage display를 이용한 돼지 PEDV 특이 scFv 작성 전략을 수정하여 수립하고 이에 따른 돼지 Fab library 구축용 21종 primer 제작 완료
12. VH, linker, VL 유전자 library 이용 PEDV 고역가 돼지 혈액으로부터 scFv 유전자 library 구축 및 염기서열 확인 후 phage display 및 반응성 확인 중
ｏ 세부과제명: 재조합 발현 PED 중화항체 Fab의 활용연구
1. 표면에 2C10 scFv 단백질을 발현하는 대장균(E-2C10) 자돈15두 5 group 구분 접종 효과 시험 수행 및 바이러스 배출 정도, 임상증상 및 폐사율, 조직병변 조사 진행
2. 표면에 2C10 scFv 단백질을 발현하는 대장균(E-2C10) 대량 발현 조건 조사

Abstract ▼

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is a causative agent of severe diarrhea which leads to death in piglets. Because of the high mortality which is up to 100% in suckling piglets, PED is an important porcine disease in Korea. In this study, we developed a prophylactic candidate using single-chain

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is a causative agent of severe diarrhea which leads to death in piglets. Because of the high mortality which is up to 100% in suckling piglets, PED is an important porcine disease in Korea. In this study, we developed a prophylactic candidate using single-chain Fvs to prevent the PEDV infection.
ScFvs of mouse monoclonal antibody which was verified to neutralize PEDV was xpressed in E.coli expression system. After the confirmation of PEDV neutralizing activity of purified recombinant scFvs by VN test, scFvs were expressed on the surface of Escherichia coli cells. The signal sequence and auto-transporter β domain of protease IgA (IgAP) of Neisseria gonorrhoeae were introduced to endow scFvs with the direction to the cell surface and the support as a transmembrane domain.
5x10 6 CFU of E. coli expressing scFvs against PEDV showed promising result of 94% foci reduction compared to wild type E. coli. This result demonstrated that E. coli expressing scFvs on the cell surface retained functional potency of parent antibody and therefore blocked PEDV infection into target cells in vitro. This in vitro assay result proposes the perspective of recombinant E. coli cells expressing scFvs as a novel prophylactic against PEDV infection.

목차 Contents

• 연구과제 최종결과보고서 Final Report (FR) ... 1
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구배경 ... 3
• 2. 연구최종목표 ... 4
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 4
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 5
• 1. 재 료 ... 5
• 2. 연구방법 및 전략 ... 6
• Ⅲ. 연구결과 ... 6
• 가. 제1세부과제명: PEDV 중화 단클론항체 작성 및 발현연구 ... 6
• 나. 제2세부과제명: 재조합 발현 PED 중화항체 Fab의 활용연구 ... 15
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 16
• Ⅴ. 고 찰 ... 17
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 17
• Ⅶ. 참고문헌 ... 17
• Ⅹ. 영문초록 ... 19