초록 ▼

￭ 영장류 세포에서 이용 가능한 영장류 promoter를 가지는 RG system 확립
- Vero cell의 ribosomal RNA를 transcription 하는 Vero cell기원의 promotor부분을 screening 하여 약 2,800bp의 DNA를 sequence 하였음.
- 유전자 비교 분석결과 NCBI의 GenBank에 등록된 human IGS + 18S 부위의 sequence와 이번 연구에서 새롭게 밝혀진 Vero cell 기원의 promoter 염기서열 부위가 91%의 유사성이 있음을 확인하였으

￭ 영장류 세포에서 이용 가능한 영장류 promoter를 가지는 RG system 확립
- Vero cell의 ribosomal RNA를 transcription 하는 Vero cell기원의 promotor부분을 screening 하여 약 2,800bp의 DNA를 sequence 하였음.
- 유전자 비교 분석결과 NCBI의 GenBank에 등록된 human IGS + 18S 부위의 sequence와 이번 연구에서 새롭게 밝혀진 Vero cell 기원의 promoter 염기서열 부위가 91%의 유사성이 있음을 확인하였으며, 특히 human polymerase I 이 전사를 시작하는 부위의 유전자 8개 중 1곳의 nucleotide가 다른 것으로 나타났음.
- Human PolI promoter를 기반으로 하는 벡터 (pHW2000)내의 다양한 Restriction enzyme site를 활용하여 human PolI promoter I 부위를 제거한 후, Vero PolI promoter를 포함하는 212bp (PolI promoter + enhancing regions)부위의 유전자로 치환하여, Vero PolI promoter 기반 vector system (pHW-vero-polI plasmid)을 확립하였음.
￭ 표준 바이러스주 유전자를 이용한 재조합바이러스 제작 및 promoter효율 분석
- A/PR/8/34 바이러스 유전자 8개를 새롭게 개발한 pHW-vero-polI plasmid에 cloning하였으며, 이를 각각의 유전자를 가진 재조합바이러스 (7+1조합)를 Vero cell에서 rescue 하는데 성공하였음.
- Luciferase를 이용한 polymerase activity 결과, Vero PolI promoter의 vector system이 기존의 human polI promoter system 보다 Vero cell에서약 1.7배(P-Value<0.05) 정도 높게 polymerase activity가 증가하는 것을 확인하였으며, human 유래의 293T cell에서도 human polI promoter system과 동등한 polymerase activity가 나타남을 확인하였음.
￭ 재조합 바이러스의 면역학적, 바이러스학적 특성 분석
- 영장류 프로모터 유래 재조합 바이러스와 parental 바이러스의 항원성을 분석하기 위하여, 마우스 및 페렛 실험을 통하여, 항원성을 비교한 결과, 2차 백신에 의하여, 항체가가 320HI 이상으로 나타나, 항원성이 매우 우수함을 확인하였음
- 바이러스 유전자 변이 양상 분석을 위해, MDCK에서 계대한 결과 12번의 계대까지 총 2 sites에서만 amino acids의 변이가 발견되었는데 M1(1 site), PB1(1 site)등으로 병원성이나 항원성과 관련된 부위는 존재하지 않았음. (유정란 (4곳 변화)보다 안정성이 높았음)

Abstract ▼

￭ Establish a reverse genetics system based on non-human primate promoter for Vero cell.
· We confirmed the polymerase I promoter region (2,800bp) from vero cell lines which is homologous to the human IGS region that contains the polymerase I promoter site.
· Genetic analysis revealed that t

￭ Establish a reverse genetics system based on non-human primate promoter for Vero cell.
· We confirmed the polymerase I promoter region (2,800bp) from vero cell lines which is homologous to the human IGS region that contains the polymerase I promoter site.
· Genetic analysis revealed that there is about 86% homology of nucleotide sequences between the IGS site of Vero cell and the human IGS + 18S site registered in GenBank; the Vero promoter varies in four nucleotide positions on the 8 critical sites of the transcription initiation site of the human polymerase I.
· Based on the polymerase I sequence data, we reconstructed a Vero PolI promoter-based pHW2000 vector by substituting the human PolI promoter region with the Vero PolI promoter region, which size is about 300-400bp (PolI promoter + enhancing regions), by using specific restriction enzyme digestion sites.
￭ Efficiency tests of recombinant viruses generated by vero polymerase I RG system
· Reverse genetics-generated viruses using 7 clones from previous system and 1 clone from new system of A/PR/8/34 virus were successfully rescued in both 293T and Vero cells.
· Based on the results of the mini-genome polymerase activity using luciferase assay, we confirmed that the new system using Vero PolI promoter increased the amount of luciferase activity approximately 2 times in Vero cell lines but similar activity in 293T human cell lines compared with the previous system which utilized human polI promoter.
￭ Antigenic and virologic characteristics of recombinant RG viruses
· To compare the antigenicities of the recombinant RG viruses, we conducted vaccination tests in mice and ferrets.
· The results demonstrated that each immunized animals acquired at least 320HI titers by 2nd vaccination.
· We also confirmed the genetic stability of the recombinant RG viruses by serial passages (at least 12 times) in MDCK and embronated chicken eggs.
· Only two mutation (each M1, PB1 gene) in MDCK- and 4 mutations in egg-passaged viruses were observed but there were no mutation in HA and NA genes (no changes for antigenicity)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 학술연구용역사업 최종결과보고서 ... 3
• 목차 ... 4
• 최종결과보고서 요약문 ... 5
• Summary ... 6
• 학술연구용역사업 연구결과 ... 7
• 제1장 최종 연구개발 목표 ... 7
• 제2장 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 21
• 제3장 최종 연구개발 결과 ... 29
• 제4장 연구결과 고찰 및 결론 ... 38
• 제5장 연구성과 ... 40
• 제6장 기타 중요변경사항 ... 41
• 제7장 참고문헌 ... 42
• 제8장 첨부서류 ... 44