초록 ▼

간흡충증은 국내에서 장내기생충증 중에 감염율이 가장 높은 기생충질환이다. 간흡충 감염은 황달, 간종대, 복수, 담관암을 일으키며, 국민건강을 위협하는 만성감염성 질환으로 병인기전에 대한 연구와 집중관리가 필요하다. 본 연구에서는 간흡충 분비배설물에 의한 숙주세포의 염증 인자 생산 및 분비량 분석하고 간흡충 전사체 정보를 생물정보학적 방법과 재조합 단백질을 이용한 시험관내 실험을 통해 염증유발 단백질을 규명하고자 하였다.
제1세부과제: 간흡충 분비배설물로 담관암 세포주 HuCCT1 세포를 처치하고 배양액에 분비되는 cytokin

간흡충증은 국내에서 장내기생충증 중에 감염율이 가장 높은 기생충질환이다. 간흡충 감염은 황달, 간종대, 복수, 담관암을 일으키며, 국민건강을 위협하는 만성감염성 질환으로 병인기전에 대한 연구와 집중관리가 필요하다. 본 연구에서는 간흡충 분비배설물에 의한 숙주세포의 염증 인자 생산 및 분비량 분석하고 간흡충 전사체 정보를 생물정보학적 방법과 재조합 단백질을 이용한 시험관내 실험을 통해 염증유발 단백질을 규명하고자 하였다.
제1세부과제: 간흡충 분비배설물로 담관암 세포주 HuCCT1 세포를 처치하고 배양액에 분비되는 cytokine 량을 ELISA로 측정하고 정량하였다. TNF-alpha, IL-6, TGF-beta 1 & 2는 24시간까지 지속적으로 분비량이 증가하였다. 특히 TGF-beta 1은 15시간 이후에 분비량이 현저하게 증가하였다. 간흡충 EST pool에서 염증유발후보 TGF-beta receptor interacting protein 1(TRIP-1)의 cDNA를 획득하고 extension PCR로 전장 cDNA를 확보하여 발현벡터에 클로닝하였다. 재조합 단백질 발현을 유도하고 정제하여 담관암세포주에 처리하여 각 cytokine의 변화를 측정하는 실험을 진행하고 있다.
제2세부과제: 간흡충 분비배설물이 처리된 담관암 세포주에서 NADPH oxidase, xanthine oxidase, inducible nitric oxide synthase의 활성에 의하여 활성산소종이 생성되며 이들에 의하여 NF-κB 활성이 유도되어 interlukin-1β, -6 (IL-1β, -6) mRNA 발현이 증가하여 염증 반응이 일어남을 확인하였다. 분비배설물 처리 시간에 비례하여 serine, threonine, tyrosine 잔기를 가진 단백질 인산화가 증가하였으며 특히 mitogen activated protein kinase에 속하는 ERK1/2, JHK의 인산화를 확인하였다. 항산화 효소인 peroxiredoxin (Prdx) 2, 3, 6 발현이 처리 시간에 비례하여 증가하였으며 산화된 Prdx가 이른 시간에 증가하였다. Prdx 6를 과발현 시킨 세포에서 분비배설물에 의한 IL-1β mRNA 발현이 부분적으로 억제되므로 활성산소종이 숙주세포의 염증 반응에 관여함을 확인하였다.

Abstract ▼

Clonorchiasis is the most prevalent disease among gastro-intestinal parasitic infections in Korea. Clonorchis sinensis infection is a chronic disease causing jaundice, liver enlargement, ascites and cholangiocarcinoma, and threatening public health. It is therefore an urgent issue to be studied for

Clonorchiasis is the most prevalent disease among gastro-intestinal parasitic infections in Korea. Clonorchis sinensis infection is a chronic disease causing jaundice, liver enlargement, ascites and cholangiocarcinoma, and threatening public health. It is therefore an urgent issue to be studied for pathogenesis and be put under controled. This study was performed to elucidate production and secretion of inflammatory cytokines from a cholangiocarcinoma cell-line cells, HuCCT1 treated with C. sinensis excretory-secretory products in vitro, and to identify inflammatory protein(s) through bioinformatic analysis on the C. sinensis EST pool and in vitro experiments using recombinant protein.
Project 1: The cholagiocarcinoma cell-line cells, HuCCT1 were treated with C. sinensis sectretory-excretory products and measured for secreted inflammatory cytokines using ELISA kit. Of the checked cytokines, TNF-alpha, IL-6, TGF-beta 1 and 2 were progressively increased for 24 hours. Especially, secretion of TGF-beta 1 increased significantly after 15 hours treatment. From the C. sinensis EST pool, a putative inflammatory cDNA of TGF-beta receptor interacting protein 1 (CsTRIP-1) was retrieved and its deleted 5'-end was extended to the first methionine by PCR and subcloned into an expression plasmid vector. Recombinant protein CsTRIP-1 will be produced and tested in vitro for activity to stimulate cytokine production of the HuCCT1 cell-line cell.
Project 2: Free radicals were enzymatically generated in C. sinensis excretory-secretory products (ESP) treated human cholangiocarcinoma cells as doseand time-dependent manners. Enzymes involved in ESP-mediated free radical production were NADPH oxidase, xanthine oxidase, and inducible nitric oxide synthase, but not 15-lipoxygenase or cyclooxygenase-2. NF-κB was activated by free radicals, leading to upregulation of inflammatory gene expression, such as interlukin-1β and -6 (IL-1β, -6). ESP treatment resulted in changes in phosphorylation patterns of proteins with serine, threonine, tyrosine residues. ERK1/2 and JNK belong to these proteins. ESP induced the expression of peroxiredoxin (Prdx) 2, 3, and 6 time dependently, along with oxidized of Prdx at early time point. Prdx 6 overexpression reduced the expression of IL-1β mRNA induced by NF-κB activation in response to ESP, indicating the involvement of free radicals.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 학술연구용역사업 최종결과보고서 ... 3
• 목차 ... 4
• I. 연구개발결과 요약문 ... 5
• 최종결과보고서 요약문 ... 5
• Summary ... 6
• II. 학술연구용역사업 연구결과 ... 7
• 제1장 최종 연구개발 목표 ... 7
• 제2장 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 9
• 제3장 최종 연구개발 결과 ... 11
• 제4장 연구결과 고찰 및 결론 ... 12
• 제5장 연구성과 ... 13
• 제6장 참고문헌 ... 15
• 제7장 첨부서류 ... 18
• III. 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 19
• 제1장 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 19
• 제2장 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 24
• 제3장. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 28
• 제4장 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 38
• 제5장 제1세부연구개발과제의 연구성과 ... 39
• 제6장 참고문헌 ... 40
• 제7장 첨부서류 ... 42
• IV. 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 43
• 제1장 최종 연구개발 목표 ... 43
• 제2장 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 47
• 제3장 최종 연구개발 결과 ... 50
• 제4장 연구결과 고찰 및 결론 ... 56
• 제5장 연구성과 ... 58
• 제6장 참고문헌 ... 59
• 제7장 첨부서류 ... 60