초록 ▼

7차 장내 기생충 실태조사에서 14종의 기생충질환 감염자수는 약 189만명으로 추산되었고 이중담관상피세포암 (cholangiocarcinoma)을 일으키는 간흡충의 충란양성률은 전체 인구 대비 2.9%로 감염자수는 140만 명으로 기생충관리의 중요한 문제점으로 대두되었다. 간흡충 (肝吸蟲, Clonorchis sinensis)은 사람에게 감염되어 간흡충증 (clonorchiasis)을 일으키는 만성 토착 기생충이다.
기생충질환의 진단에 고전적으로 사용되고 있는 MGL법은 장시간 소요되는 전처리 과정, 과도한 인력 소모, 독성약

7차 장내 기생충 실태조사에서 14종의 기생충질환 감염자수는 약 189만명으로 추산되었고 이중담관상피세포암 (cholangiocarcinoma)을 일으키는 간흡충의 충란양성률은 전체 인구 대비 2.9%로 감염자수는 140만 명으로 기생충관리의 중요한 문제점으로 대두되었다. 간흡충 (肝吸蟲, Clonorchis sinensis)은 사람에게 감염되어 간흡충증 (clonorchiasis)을 일으키는 만성 토착 기생충이다.
기생충질환의 진단에 고전적으로 사용되고 있는 MGL법은 장시간 소요되는 전처리 과정, 과도한 인력 소모, 독성약품 처리를 위한 열악한 환경을 개선할 필요가 있다. 또한 낮은 충란 검출률과 충란 감별진단에 필요한 전문성을 극복할 수 있는 간편하고 신속하며 일반실험실과 현장에서 바로 적용할 수 있는 새로운 현장진단방법 (POCT, point-of-care testing) 개발이 필요하다.
본 연구에서는 간흡충의 효율적 진단을 위하여 대변검사 전처리 과정의 간소화, 검출률 향상, 충란감별 진단의 전문성을 극복할 수 있는 신속 진단키트 (rapid diagnosis test; RDT)를 제조하고 그 유용성을 평가하고자 하였다.
간흡충 충란을 항원으로 사용하여 간흡충 충란 특이 단클론항체를 제작하였다. 간흡충 충란을 항원으로 사용하여 ELISA, strip assay, line assay, dot assay를 수행하여 민감도와 특이도가 우수한 4개 융합세포주를 선별하였다. 정제된 간흡충 충란 단클론항체는 충란과 특이적으로 결합하여 충란의 표면에 형광이 발현되는 것이 관찰되었다. 대변으로부터 신속하게 간흡충 충란을 진단하기 위해서 금또는 라텍스 입자에 충란항원에 특이적인 항체를 축합시키고 응집반응을 특수 재질의 유리판에서 확인하였다. 경쟁적 라텍스 응집법 (competitive latex agglutination)을 이용하여 진단키트의 간흡충 충란반응성을 확인한 결과 간흡충 충란 특이항체는 간흡충 충란과 경쟁적으로 결합하여 응집 반응이 관찰되지 않았다. 간흡충 충란 진단키트의 민감도 확인 결과 진단키트의 민감도는 간흡충 충란 lysate 10 ug으로 예상되었다. 그리고 간흡충 충란 진단키트를 제작하거나 검체를 수집하는 과정 등에서 함입될 수 있는 8가지 성분들에 대하여 1,000 ug/ml 농도에서 교차반응이 관찰되지 않았다. 간흡충 및 장흡충 양성 환자의 대변에 대한 민감도와 특이도는 각각 78%와 95% 이었다.
본 연구에서 간흡충 충란에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 제작하였고 이를 이용하여 간흡충 충란 진단키트를 개발하였다. 이 진단키트는 교차반응이 없는 민감도와 특이도가 우수한 진단키트이다. 그러므로 이 키트는 간흡충의 효율적 진단을 위하여 대변검사 전처리 과정의 간소화, 검출률 향상, 충란 감별 진단의 전문성을 극복할 수 있는 신속 진단키트 (rapid diagnosis test; RDT)가 될 것으로 사료되며 향후 보정 연구를 통하여 국가기생충 진단 표준품으로 적용됨으로서 국가 보건안정망 구축에 기여하며 다른 기생충질환 진단키트 개발에 응용할 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼

In the research of 7th Prevalence of Intestinal Parasitic Infections in Korea 2004, approximately 1.89 million people are estimated to be infected 14 kind’s parasites. 2.9% of people were infected with Clonorchis sinensis and about 1.4 million people are estimated to be infected with this parasite.

In the research of 7th Prevalence of Intestinal Parasitic Infections in Korea 2004, approximately 1.89 million people are estimated to be infected 14 kind’s parasites. 2.9% of people were infected with Clonorchis sinensis and about 1.4 million people are estimated to be infected with this parasite. Clonorchis sinensis is endemic in Korea and promotes development of cholangiocarcinoma in human. Recently, C. sinensis was officially classified as a Group 1 biological carcinogen by the World Health Organization. Parasitological microscopic stool examination remains the standard method for diagnosing clonorchiasis. However, MGL method using formalin-ether centrifugal sedimentation technique is time consume, expensive and use toxic reagents. Moreover, it is still difficult to diagnosis by egg and low infection because it need expert technician. More suitable diagnostic method is required for rapid and easy diagnosis such as point-of-care testing (POCT).
This study we developed rapid diagnosis test (RDT) and estimate efficiency and utility. This kit is more simple preprocess, enhancing diagnostic efficiency and may overcome weakness of existing diagnosis methods.
Using C. sinensis egg lysate for antigen, we made egg specific monoclonal antibody. We selected 4 hybridoma strains by ELISA test, strip assay, line assay and dot assay. Purified monoclonal antibodies are specifically reacted with C. sinensis egg surface by indirect fluorescence assay. Colloidal gold and latex particle (200 um diameter) are conjugated with goat anti-mouse IgG and adsorbed into glass reaction plate for rapid diagnosis of C. sinensis egg from stool. In competitive latex agglutination, C. sinensis specific monoclonal antibody was competitively combined with eggs and observed no agglutination reaction. Sensitivity of rapid C. sinensis egg detection kit was estimated 10 ug of egg lysate. Rapid C. sinensis egg detection kit had no cross reaction with 8 kinds of reagents that could be contaminated in process of stool preprocessing and kit production. The sensitivity and specificity for stool of clonorchiasis and other intestinal parasites are 78% and 95%, respectively.
In this study, we made C. sinensis egg specific monoclonal antibody and rapid C. sinensis egg detection kit using this antibody. This kit was ability and had high sensitivity and specificity and had no cross reaction. Additionally, this kit can be a rapid diagnosis test (RDT) and overcome simplify of stool preprocessing course, enhancing of egg detection rate, and necessity expert skill to differential diagnosis of eggs. This rapid C. sinensis egg detection kit could be contributed to eradication of clonorchiasis and should be further studied to develop other parasites rapid diagnostic test kits.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• Ⅰ. 연구개발결과 요약문 ... 5
• (한글) 간흡충란 검출용 래피드 진단키트 개발 ... 5
• (영문) Development of rapid diagnostic kit for Clonorchis egg detection ... 6
• Ⅱ. 학술연구용역사업 연구결과 ... 7
• 제1장 최종 연구개발 목표 ... 7
• 1.1 목표 ... 7
• 1.2 목표달성도 및 관련분야에 대한 기여도 ... 11
• 1.3 국내·외 기술개발 현황 ... 12
• 제2장 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 14
• 2.1 연구배경 ... 14
• 2.2 연구내용 ... 14
• 2.3 연구방법 ... 14
• 제3장 최종 연구개발 결과 ... 23
• 3.1 연구개발 결과 ... 23
• 제4장 연구결과 고찰 및 결론 ... 39
• 제5장 연구성과 및 활용계획 ... 43
• 5.1 활용성과 ... 43
• 5.2 활용계획 ... 44
• 제6장 기타 중요변경사항 ... 45
• 제7장 연구비 사용 내역 ... 45
• 제8장 참고문헌 ... 46
• 제9장 첨부서류 ... 47