초록 ▼

본 중점과제의 목적은 새로이 출현하는 전염병에 대해 신속히 원인을 규명하고, 전파을 억제하며, 발생을 예방함으로써 국민의 건강을 증진함에 있다. 우리나라에서 발생하는 전염병은 다른 나라에서 수행된 연구 결과만으로는 해결할 수 없기 때문에 기초역학자료 조사, 유행 병원체의 확인, 신속 진단·검색법의 개발, 백신 및 치료제의 개발, 예방 및 관리와 관련된 분야를 연구하였다.
국내 삼일열 원충감염의 잠복기와 관련된 유전자 요소를 알아보기 위해 삼일열원충의 CSP와 MSP 유전자를 클로닝하였다. 국내에 혼재하는 두 종류의 CSP 유전

본 중점과제의 목적은 새로이 출현하는 전염병에 대해 신속히 원인을 규명하고, 전파을 억제하며, 발생을 예방함으로써 국민의 건강을 증진함에 있다. 우리나라에서 발생하는 전염병은 다른 나라에서 수행된 연구 결과만으로는 해결할 수 없기 때문에 기초역학자료 조사, 유행 병원체의 확인, 신속 진단·검색법의 개발, 백신 및 치료제의 개발, 예방 및 관리와 관련된 분야를 연구하였다.
국내 삼일열 원충감염의 잠복기와 관련된 유전자 요소를 알아보기 위해 삼일열원충의 CSP와 MSP 유전자를 클로닝하였다. 국내에 혼재하는 두 종류의 CSP 유전자의 연간 발병률은 서로 유사하였으며, MSP 유전자에서는 특이한 insertion/ deletion이 있었지만 두 유전자 모두 잠복기에 따른 변이는 없었다. 말라리아 배양에 필요한 배지, multigas 배양기, 정상 및 감염적혈구의 분리, 동결, 해빙 및 감염혈액으로부터 각 state의 원충 분리 방법을 확립하였다. 국내 삼일열 말라리아 유전자 중 AMA- 1과 MSP - 1 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 국내 삼일열 말라리아는 크게 두 가지 충주로 분류되었다. 삼일열 말라리아의 혈청학적 진단, 유행지에서 감염대책 확립 및 수혈시 선별검사 등을 위해 CSP - 1, MSP - 1, AMA - 1, SERA, 및 EXP - 1를 이용한 다항원 ELISA를 확립하였다. 유행지역에 거주하는 3,262명 중 ELISA 방법으로 236건(7.2%)의 항체 양성자를 확인하였다. 삼일열 말라리아에서 ookinete stage의 sexual surface protein (Pv25,Pv28)을 인지하는 유전자를 cloning하고 발현시켰다. 염기서열 분석 결과 한국의 삼일열 말라리아에서는 EGF - like domains이 4개이며 반복되는 염기서열(GSGGE/D)이 다른 삼일열 말라리아와는 다르게 7번 반복되었다. 발현된 단백질은 Pv25는 25kDa이고 Pv28은 28kDa이었다. TBV(transmission blocking vaccine)의 유용성 평가 결과 모기에서 말라리아 생활사가 차단됨이 확인되었다. 환자의 혈액으로 부터 MSP와 CSP부위 유전자를 증폭하고 plasmid vector로 재조합 단백질을 제조한 후 환자의 혈청과 반응시켜 IgG 항체의 민감도를 확인하였다. 세포배양 실험을 통해 plasmid DNA의 기능을 확인하였으며, 동물실험에서 CSP/MSP 항체 detection kit로 anti- CSP 항체를 검출하였다.
우리나라에서 새로 출현하거나 갑자기 증가된 전염병가운데 유행성 위장관 감염을 일으키는 세균성 전염병의 원인체 가운데 대표적인 네가지 균속을 대상으로 병인론적 연구를 다면적으로 접근하여 예방 및 치료방법의 근거를 제시하고 백신개발 등의 궁극적인 목표를 달성하고자 하였다. 이질균 병원성유전자의 발현의 차이를 규명·발견하였으며, 병원성 변이형이 백신후보물질로 가능함을 확인하였다. 살모넬라가 숙주세포에 침투하여 성장하는 것을 조사하기 위하여 gentamicin을 배지에 첨가함으로써 숙주세포 내에 존재하는 세균의 성장을 저해하는 것을 밝혔고, 숙주 세포의 사멸은 세균의 생장과 무관하고 배지내에 혈청성분이 있으면 일정한 시간 경과후 사멸함을 확인하였다. EHEC를 동정하는데 Shiga 독소 유전자에 특이적인 oligonu cleotide를 이용한 colony hybridization 검사가 비교적 민감도가 높고 특이도가 매우 높은 검사방법이었지만, 민감도를 높이기 위해 EHEC를 선택적으로 증식시켜 검사할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요할 것이다. 장관상피세포에서 V. vulnificu s가 일차적으로 부착하고 침입하는데 OmpU가 virulence에 중요한 역할을 하며, hemoly sin과 같은 외독소도 중요하리라 판단된다.
최근 세계적으로 문제되고 있는 내성균주의 역학과 내성기전 등 국내현황을 파악하여 감염증 치료와 확산 방지에 중요한 기초자료를 제공하고자 하였다. 전국 12개 병원 환자에서 분리한 E. coli와 K. pneumoniae 중 ESBL 생성 균주는 각각 9.1%와 29.2%이었다. SHV형은 SHV- 12와 SHV- 2a가, TEM형은 TEM- 52가 흔하였다. 그리고 새로운 변이형인 TEM- 106, TEM- 107 생성 균주도 검출되었다. 국내 분리 폐렴구균은 외국 분리주에 비하여 항균제 내성율이 현저히 높았고, 다제 내성 균주들 사이에는 분자역학적 상관성이 있었다. 황색포도구균 중 4%가 VRSA 선별시험 양성이었으나, VRSA는 없었다. 반코마이신를 투여해도 계속 분리된 MRSA 역시 VISA 혹은 hetero- VISA는 아니었다. MRSA의 97%는 MLSb 내성이었다. 전국 200개 병원 중 장구균 균속의 동정이 가능한 검사실은 94%, VRE 분리환자의 격리수용지침 보유 병원은 23%, VRE 분리율은 0- 83% (평균 4.4%), 중환자실 환자의 직장내 VRE 보균율은 평균 37.9%이었다. vanA gene 분석결과 수평전달에 의한 내성전파가 대부분이었다.
10년간 우리나라 소아에서 분리된 adenovirus의 혈청형, 3형과 7형의 유전형 및 이들의 유행 양상을 파악하였으며, 3형과 7형의 hexon과 fiber유전자는 상동성이 있었다. 1998년과 2001년까지 무균성 뇌막염 환자에서 분리된 장바이러스에 대해 바이러스배양, 역전사 중합효소연쇄반응 후 염기서열 분석, 항체중화시험, 단일세포군 항체를 이용한 효소면역측정법 등을 시행하여 혈청형과 유행양상을 규명하였다. HIV감염의 질병진전에 관여하는 것으로 추정되는 MICA 유전자, 사이토카인 유전자형, Costimulatory분자(CTLA- 4) 유전자형을 분석하여 IFN- γ생산과 관련된 대립유전자의 표현이 감소되는 경향과 CTLA- 4 유전자형이 정상인에 비해 유의한 차이를 보이지 않음을 확인하였다. 국내 HIV 감염자의 림프구에서 HIV의 protease와 reversetranscriptase 유전자를 증폭하여 분석한 결과 항바이러스제를 투여 받지 않은 경우에는 내성 유전자 빈도가 낮기 때문에 일반적인 항바이러스제 병합요법의 원칙을 따르는 것이 바람직하지만, 치료력이 있는 경우에는 RT 유전자의 M184V 변이가 현저히 높기 때문에 이에 대한 조사가 필요하다는 것을 확인하였다. 우리 나라 에이즈 환자 가운데 결핵은 6.9/ 100 person - year의 빈도로 발생하며 임상 양상도 파종성 혹은 폐외 결핵이 많으며, 세포면역능이 HAART 후 회복되는 경향을 보였다. 하지만, HIV 감염자가 동시에 결핵에 감염된 경우 결핵에 대한 특이 세포면역능은 정상인과 비슷한 정도였다.
리켓치아 질환에 대한 역학과 특징을 규명하고 항생제 감수성 검사법을 확립하여 효과적인 진단과 치료가 가능하도록 하며, 효과적인 백신개발을 시도하고자 하였다. 급성 열성질환 환자 5,800 예의 혈청에서 rickettsiaceae에 속한 R. typ hi, R. prowazekii, R. akari, R. conorii, R. sibirica, R. japonica, Ehrlichia sennetsu, Coxiella burnetii 등 8가지 균주에 대한 항체 유무를 검사하여 국내에서 발생보고가 없었던 여러 리켓치아 질환을 의심할 수 있었다. 분리 균주중 doxycycline에 내성을 보이는 균주는 없었다. O. tsutsugamushi의 여러 단백 가운데 47kDa 단백은 세균의 부착에는 기능을 담당하지만, 예방백신으로서의 효율적인 방어능을 나타내지는 못하였다. 그러나 주요 표면항원인 56kDa 단백은 CpG-ODN과 함께 면역한 경우, 기존에 사람에게 허용된 alum을 사용하는 경우보다 세균의 감염에 대한 저항성과 방어에 효과적인 세포매개 면역능 유발이 우수하였으므로 CpG- ODN이 O. tsutsugamushi에 대한 백신개발에 면역강화제로서 기여할 수 있을 것으로 기대되었다.

Abstract ▼

To investigate the genetic factors influencing long or short incubation period, CSP and MSP genes were cloned and sequenced. At least two types of CSP gene and MSP gene containing specific insertion and deletion were found. However, there was no relation between in cubation period and the gene seque

To investigate the genetic factors influencing long or short incubation period, CSP and MSP genes were cloned and sequenced. At least two types of CSP gene and MSP gene containing specific insertion and deletion were found. However, there was no relation between in cubation period and the gene sequences, suggesting other factors as sociated with the different incubation periods. Culture system in cluding medium preparation, multigas incubator, red blood cell purification from normal and infected blood, thawing, freezing, and purification of each P. vivax stage was established. The PvMSP-1 and PvAMA-1 gene nucleotide sequence was investigated. ELISA has been established to diagnose vivax malaria using multiple stage-specific recombinant antigens, such as CSP-1, MSP-1, AMA-1, SERA, and EXP-1, which would be applied to serological diagnosis and mass screening. Pv25 and Pv28 on the surface of ookinetes were isolated, cloned and expressed. In experiments using the monoclonal antibodies against transmission blocking protein, Pv25 and Pv28, group treated with monoclonal antibodies was less infected than control group. MSP and CSP PCR products were cloned into the pcDNA eukaryotic expression vector. The expression of the these gene constructs was verified in vitro transfection into the myoblast cell (C2C12). The MSP and CSP expressing plasmids were used to immunize mice via cation liposome. Two out of five cases are detected weak antibody titer via MSP and CSP antibody detection kit.
Large virulence plasmid was confirmed in both species of S. sonnei and S. flexneri since early 1980s, but the isolates of sporadic shigellosis presumed to be some defects in plasmid-encoded virulence genes. Loss of HeLa cell cytotoxicity was identified in S. flexneri 82DH089 and S. sonnei 80DH248 which were isolated in 1980s. The gene sequen ces of ipaB, ipaC, and other plasmid encoded genes of S. flexneri 82DH089 were intact but only icsA gene showed segment deletion in the region 1319 and 1362 of reference gene icsA (pMYSH6000). Transcription activity of icsA gene of 80DH248 and 82DH089 strains was lower than that of outbreak-associated isolat es in 1999 by northern blot hybridization. Gentamicin resistant test, which has been routinely used to analyze the intracellular growth of S. typhimurium within eukaryotic host cell, showed gentamicin in the media can affect the intracellular growth. Also host cell underwent cell death in the absence of bacterial replication. The host cell death required serum component. Even at $10^{3}$ CFU per 0.1g of stool, stx-producing E. coli could be detected by colony hybridization with stx-specific oligonucleotide. Of 588 stools, 2 stx1 gene and 5 stx2 gene were detected by PCR. Colony hybridization detected 1 stx1-positive E. coli and 4 stx2- positive E. coli of 7 PCR positive stools. Use of selective enrichment media would be warranted to improve the sensitivity. The outer membrane protein OmpU of Vibrio vulnificus may play the very import ant role in adhesion to intestinal epithelium of host and invasion into blood stream. Hemolysin produced by V. vulnificus also may play an important role in invasion into blood through the intestinal wall.
To provide the important guidelines for the treatment and control of resistant bacteria, epidemiological characteristics of ESBL-producing Escheriachi coli and Klebsiella pneumoniae, multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae, vancomycin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant enterococci were determined. For the clinical isolates from several tertiary hospitals, antimicrobial susceptibility, serotyping, screening and confirmatory tests were performed. And also for some species, the resistant genes were detected by PCR and then sequenced. Among the E. coli and K. pneumoniae isolates, ESBL producers accounted for 9.1% and 29.2%, respectively. SHV-12, SHV-2a and TEM- 52 were prevalent. New ESBL variants, TEM-106 and TEM-107, were identified. The resistance rates of S. pneumoniae were higher than those in other countries. For the MDR S. pneumoniae strains, some genetic relations were shown by PFGE and PBP PCR fingerprinting. VRSA screening test showed 4.0% (27/682) of MRSA were positive, but none of them was VISA or hetero-VISA. MRSA consecutive isolates from persistent bacteremia cases, were not VISA or hetero-VISA. The $MLS_{b}$ resistance rates were 37% for MSSA and 97% for MRSA strains. Ninety-four percent of clinical laboratories had ability to identify enterococci, 23% of hospitals had the guideline of isolation for patients with VRE, the prevalence of VRE was 0-83% depending hospitals (mean 4.4%), and the average rectal carriage rate of VRE in ICU patients was 37.9%. The horizontal spread of vancomycin-resistance in enterococci was assumed to be the major mechanisms by PFGE and vanA gene cluster analysis.
The serotypes of adenovirus, genotypes of type 3, 7 and epidemiology of adenovirus isolated from children over the past 10 years were investigated. The homology of hexon and fiber genes between type 3 and 7 was revealed. For the detection of enterovirus from the patients with aseptic meningitis and the determination of serotype, virus culture and amplification by RT-PCR were performed. Their serotypes were determined by comparison of the homology of nucleic acid sequences, the antibody neutralization test, and ELISA. There were several epidemics from 1999 to 2001. To study the genetic influences on disease progression , 3 kinds of immuno responsible genes, including MICA genes, cytokine genotypes and costimulatory molecule (CTLA-4) genotypes, were analyzed. In HIV patients, the expression of the genes responsible for IFN-γ production tends to be decreased, but no significant difference was shown in CTLA-4 gene compared with that in normal people. To analyze the characteristics and frequency of genotypic resistance, the protease and reverse transcriptase genes of HIV were amplified. While the incidence of genotypic resistance was low in treatment-naive individuals, M184V mutation was exceedingly frequent in HAART - experienced individuals. The study about the incidence, outcome, and pathogenesis of tuberculosis in HIV-infected persons in Korea revealed that incidence of tuberculosis in AIDS patients was 6.9/ 100 person-year. Disseminated or extrapulmonary tuberculosis was more common. The cell-mediated immunity of HIV infected persons was decreased but recovered after antiretroviral therapy. When they had both HIV infection and tuberculosis, the cell-mediated immunity was reserved as much as normal control.
Besides genetically engineered 56kDa antigen that provided protection against lethal challenge in a mouse model, other proteins as vaccine candidates was evaluated and compared on the adjuvant effects for eliciting effective cell-mediated immunity. CpG- ODNs enhances the cell-mediated immune response with Bor56 and thus could be an effective adjuvant for against O. tsutsugamushi infection. For the epidemiological study of the rickettsial diseases, 5,800 sera from the patients with acute febrile illness were collected and analyzed for 8 rickettsial diseases by IFA and western blotting, such as Rickettsia typhi, R. prowazekii, R. conorii, R. akari, R. sibirica, R. japonica, Ehrlichia sennetsu, and Coxiella burnetii. These studies in dicate that suspection of several rickettsial diseases in Korea and could be concentrated in diagnosis and treatments of these diseases. Because there were no standard tools of antibiotic susceptibility test for O. tsutsugamushi, antibiotic susceptibility methods and mechanisms of pathophysiologic changes were suggested. Most of O. tsutsugamushi isolated from patients were Gilliam and Boryong strains. In Korean isolates susceptible to tetracycline, heat-stable molecules of O. tsutsugamushi might be responsible for the induction of inflammatory cytokines.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 5
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 7
• Project Summery ... 9
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 11
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 11
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 21
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 26
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 29
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 35
• 6. 첨부서류 ... 36
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 37
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 39
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 40
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 51
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 82
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 86
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 92
• 7. 참고문헌 ... 95
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 98
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 99
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 102
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 111
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 132
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 141
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 142
• 7. 참고문헌 ... 143
• 제3세부 연구개발과제 연구결과 ... 152
• 1. 제3세부 연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 153
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 154
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 163
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 191
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 199
• 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 202
• 7. 참고문헌 ... 204
• 제4세부연구개발과제 연구결과 ... 212
• 1. 제5세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 213
• 2. 제4세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 215
• 3. 제4세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 222
• 4. 제4세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 247
• 5. 제5세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 254
• 6. 제5세부연구발과제의 활용계획 ... 255
• 7. 참고문헌 ... 258
• 제5세부연구개발과제 연구결과 ... 261
• 1. 제5세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 262
• 2. 제5세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 263
• 3. 제5세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 265
• 4. 제5세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 271
• 5. 제5세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 272
• 6. 제5세부연구발과제의 활용계획 ... 273
• 7. 참고문헌 ... 274
• 첨부자료 ... 279