보고서 정보
주관연구기관 |
비피도(주) BIFIDO Co.Ltd |
연구책임자 |
지근억
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참여연구자 |
오덕근
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2003-05 |
과제시작연도 |
2002 |
주관부처 |
보건복지부 |
과제관리전문기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201300001260 |
과제고유번호 |
1460000490 |
사업명 |
보건의료기술개발사업 |
DB 구축일자 |
2013-05-20
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키워드 |
생리활성물질.효소적 생산.conjugated linoleic acid.cis.9-trans.11-octadecanoic acid.Bioactive substance.
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초록
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(1) 최종 개발의 목표
- Linoleic acid isomerase 효소 생산 재조합 미생물 제조
- 유전자 진화를 통한 반응속도 및 효소 특성 개량
- 효소 정제 및 특성 조사
- 고정화 방법 및 반응조건 개발
- 생물반응기 작동 조건 최적화 : 전환수율 90%이상, 생산성 3.0 g/L-h, 30일 이상 작동
- CLA 정제 조건 최적화: 정제수율 80%이상, CLA 함량 90%이상
- Scale-up 및 CLA 시제품 생산: 전환수율 90%이상, 생산성 3.0 g/L-h, 30일 이상
(1) 최종 개발의 목표
- Linoleic acid isomerase 효소 생산 재조합 미생물 제조
- 유전자 진화를 통한 반응속도 및 효소 특성 개량
- 효소 정제 및 특성 조사
- 고정화 방법 및 반응조건 개발
- 생물반응기 작동 조건 최적화 : 전환수율 90%이상, 생산성 3.0 g/L-h, 30일 이상 작동
- CLA 정제 조건 최적화: 정제수율 80%이상, CLA 함량 90%이상
- Scale-up 및 CLA 시제품 생산: 전환수율 90%이상, 생산성 3.0 g/L-h, 30일 이상 작동
(2) 연구개발내용 및 방법
제 1 세부과제
- Linoleic acid isomerase 효소를 생산하는 재조합 균주 개발(Bifidobacterium, E.coli.)
- 유전자 진화를 통한 반응속도 및 효소 특성 개량: 내열성 부여 및 활성부위 변형
- Linoleic acid isomerase 효소의 생산 조건 최적화: pH, 온도, 배지성분
- CLA 정제 조건 최적화: FPLC, 유기용매 , urea, 초임계 이산화탄소 조사
- Scale-up 및 CLA 시제품: pilot에서 결과 재연
제 2 세부과제
- Linoleic acid isomerase 고생산 균주 개발: 균주선별
- 효소 정제 및 특성 조사: 기질, 온도, pH, 무기염 영향,
- 고정화 방법 및 반응조건 개발: 여러 담체, 여러 고정화 방법, 기질, 온도, pH 등의 영향
- 생물반응기 작동 조건 최적화 : 기질의 농도, 유속, 고정화된 담체의 양 등을 최적화
- 생물반응기 scale-up: 기하학적, 생화학적, 물리적 유사성 인자 scale-up
(3) 연구개발결과
제 1 세부과제
- Lactobacillus reuteri와 Propionibacterium acnes의 Linoleate isomerase 유전자를 확보함.
- 위의 두 유전자를 대장균 발현벡터인 pEGFP와 pET 벡터에 클로닝하여 발현함.
- 세포외 분비를 위하여 비피더스 발현 및 분비 벡터를 제조하고 secretion signal을 이용하여 클로닝함.
- 식품용으로 개발하기 위하여 비피더스 발현벡터에 클로닝하여 발현함.
- Lb. reuteri의 linoleate isomerase 유전자의 hydrophobic domain을 제거하고 secretory signal과 재조합을 시도함.
- 형질전환체에서 CLA의 생산을 확인함.
제 2 세부과제
- 발효에 의한 CLA 생산: 24시간 배양 후 300 mg/l로 30% 전환률
- Washed L. reuteri 세포에 의한 CLA 생산: CLA 생산 조건은 37℃, pH 9.5에서 기질 농도 500 mg/l의 LA를 사용하여 1시간 반응하였을 때 228.5 ug/ml 생성
- 효소정제: SDS PAGE에 loading하여 45에서 70 kilodaltons의 4개의 band를 얻음
- 고정화 Lactobacillus reuteri 세포로부터 CLA 생산: 10 mg cells / 1g silica gel, 1시간, 500 mg/l LA가 최적임을 확인, 175 mg/l CLA가 생산됨으로써, washed free cell의 경우에 비해 5.5배의 CLA 생산성 증대
- 고정화 세포의 재사용을 위한 최적 조건: 고정화 세포 재사용시 CLA 생산 최적 조건은 1.0 mM $Cu^{2+}$가 첨가된 pH 7.5 완충용액을 이용하여 25℃에서 다섯회 반복 사용한 경우가 가장 효과적인 것으로 나타났다. 이때 생산된 총 CLA 양은 344 mg/l이며, 이는 고정화하지 않은 세포에 비해 8.6배의 높은 CLA 생산성
- 고정화 효소로부터 CLA 생산 최적화: 최대 CLA 생산성은 pH 10.0 및 45℃이고 $Cu^{2+}$의 경우 무첨가에 비해 110%의 CLA 생산 증대를 보였다. 안정성은 pH 7.0 및 25℃에서 가장 안정하였다.
- Bioreactor: pH는 7.5 온도는 25℃에서 고정화된 L. reuteri는 CLA를 최초 1시간 동안 최대생산성 115 mg/L·h을 나타내었고 15번의 residence time 동안 평균 생산성 62 mg/L·h 으로 연속적으로 생산되었다. 15번의 residence time(15시간) 동안 총 생산된 CLA는 반응기 부피당934 mg-CLA 이었다. 이러한 결과는 재사용반응에서 자유세포의 생산량의 16.8배 해당되는 것이다.
Abstract
▼
(1) Objectives
- Development of recombinant microorganism producing Linoleic acid isomerase
- Improvement of enzymatic character by gene manipulation
- Enzyme purification and characterization
- Enzyme immobilization and optimization of reaction condition
- Optimization of bioreactor
(1) Objectives
- Development of recombinant microorganism producing Linoleic acid isomerase
- Improvement of enzymatic character by gene manipulation
- Enzyme purification and characterization
- Enzyme immobilization and optimization of reaction condition
- Optimization of bioreactor : conversion efficiency >90%, Yield 3.0 g/L-h, working for 30 days
- Optimization of CLA purification process : yield > 80%, purity (CLA) > 90%
- CLA fortified fermented milk: containing more than 10 times of CLA than general fermented milk
- Scale-up and producing CLA sample product
(2) Research scopes and methods
- Screening of CLA producing bacteria and Cloning of Linoleic acid isomerase gene from them by using general genetic engineering techniques
- Development of recombinant E. coli and Bifidobacterium producing Linoleic acid isomerase using the cloned gene and each expression system.
- Improvement of enzymatic characteristics of linoleate isomerase through recombinant DNA technology
- Enzyme purification and characterization by analysis of substrate specificity, temperature and pH stability and effects of inorganic salt
- Optimization of enzyme production by controlling culture medium and condition.
- Optimization of enzyme immobilization and development bioreactor.
- Optimization of purification process of CLA
- Scale up
(3) Results
Two types of Linoleate isomerase genes have been cloned from Lactobacillus reuteri and Propionibacterium acnes. Those genes were cloned and expressed in E. coli using pEGFP and pET vectors. According to the sequence analysis, linoleate isomerase gene from Lb. reuteri was predicted to have N-terminal hydrophobic domain. It was designed to eliminate the hydrophobic domain and subclone into expression vector to avoid inclusion body. The recombinant E. coli strains showed CLA product though low level. It was also tried to clone Linoleate isomerase genes into Bifidobacteria expression and secretion vector (pBESAF2). It also showed CLA productivity.
The addition of 1,000 mg/l linoleic acid (LA) in 1.77% (v/v) Tween-80 as a micelle solution to culture medium enhanced conjugated linoleic acid (CLA) conversion during Lactobacillus reuteri fermentation due to the reduction of LA toxicity to the cells. The CLA level in the culture medium increased to 300 mg/l after a 24-h incubation with a 30% conversion yield. The CLA formed by L. reuteri cultivation was found mostly in the extracellular space. LA-adapted washed cells were less active than unadapted washed cells in converting LA into CLA. Most of the CLA transformed by washed L. reuteri cells was found in cells or associated with cells. CLA production by washed L. reuteri cells was efficient with 500 mg/l LA in pH 9.5 reaction buffer at 37℃ for 1 h.Lactobacillus reuteri was immobilized on silica gel for the continuous bioconversion of linoleic acid (LA) to conjugated linoleic acid (CLA). The reaction time, the substrate concentration, and the cell amount to carrier for CLA production by the immobilized cells were optimized to be 1 h, 500 mg/L LA, and 10 mg cells per g carrier, respectively. Under the optimal conditions, the immobilized cells produced 120 mg/L CLA from 500 mg/L LA for 1 h with a productivity of 120 mg/Lh and accumulated CLA 4 times higher than that obtained from the bioconversion of free cell. The pH and temperature for the maximum CLA production was pH 10.5 and 55℃, respectively. The presence of copper ion enhanced slightly CLA production. Because the cells that were preincubated with CLA lost almost their ability to produce more CLA from LA, CLA-producing ability of the reused cells for 5 reused reactions were investigated. The total produced amount of CLA for 5 reused reactions was maximal at pH 7.5 and 25℃. Under the conditions, an immobilized L. reuteri on silica gel in a packed-bed bioreactor produced continuously CLA with a maximum productivity of 115 mg/Lh for 1 h and with an average productivity of 62 mg/Lh for 15 h. The total amount of CLA produced for 15 residence time, 15 h, was 933.5 mg-CLA per L-reactor volume. This amount was 16.8 times higher than that obtained from the reused reaction of free cell.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- 목차 ... 4
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
- Project Summery ... 7
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 12
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 38
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 41
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 43
- 6. 첨부서류 ... 43
- 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 44
- 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 45
- 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 45
- 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 46
- 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 57
- 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 58
- 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 59
- 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 60
- 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 61
- 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 61
- 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 및 고찰 ... 65
- 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 결론 ... 90
- 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 92
- 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 93
- 7. 참고문헌 ... 93
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