초록 ▼

국내에서 자생하는 Alnus속 식물들로부터 발암억제약물(Anti-tumour promoting agents)로써 diarylheptanoid화합물을 분리하고 이들 diarylheptanoid화합물의 구조 와 활성의 상관성을 조사하여 선도 화합물을 도출하고 대량생산시스템을 확립함으로써 암을 예 방하고 치료할 수 있는 개념(Chemopreventives)의 발암억제 의약품의 소재를 개발하고자 하였다.
그 결과 오리나무 Alnus japonica의 수피를 추출, 분리 정제하여 10종의 diarylheptanoid 화합물을 분리하였으

국내에서 자생하는 Alnus속 식물들로부터 발암억제약물(Anti-tumour promoting agents)로써 diarylheptanoid화합물을 분리하고 이들 diarylheptanoid화합물의 구조 와 활성의 상관성을 조사하여 선도 화합물을 도출하고 대량생산시스템을 확립함으로써 암을 예 방하고 치료할 수 있는 개념(Chemopreventives)의 발암억제 의약품의 소재를 개발하고자 하였다.
그 결과 오리나무 Alnus japonica의 수피를 추출, 분리 정제하여 10종의 diarylheptanoid 화합물을 분리하였으며, 각종 물리화학적 성상과 기기분석 결과를 해석하여 각각 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-3-O-β-D-glucopyranosyl(1→3)-β-D-xylopyranoside (1), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-3-O-β-D-apiofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside (2) ,1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-5-O-β-D-glucopyranoside (3), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptan (4), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-3 -one-5-O-β-D-glucopyranoside (5), oregonin (6), hirsutanonol (7), hirsutenone (8), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane-3-O-β-D-xylopyranoside (9) 및 platyphylloside (10) 로 구조결정 하였다. 특히 1 및 9 화합물은 천연에서 처음 발견되는 신물질로 확인되었다.
선도화합물을 도출하기 위해 각종 활성 실험을 실시하여 MTT assay에서 melanoma cell에 대해서 20μM 농도에서 증식억제 효과가 나타났으며 화합물 oregonin (6), hirsutanonol (7), hirsutenone (8), platyphylloside (10) 등이 비교적 강력한 증식억제활성을 나타내었고 Human Cancer cell에 대해서는 위암세포주에서 화합물 hirsutanonol (7) 과 platyphylloside (10) 이 간암세포에서는 화합물 hirsutanonol (7)과 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane-3-O-β-D-xylopyranoside (9)가 결장암 세포에서는 hirsutanonol (7)과 platyphylloside (10) 이 비교적 강한 세포독성을 나타내었다.
항산화실험에 있어서는 DPPH radical 에 대하여 모든 diarylheptanoid 화합물이 우수한 항산화활성을 보여주었으며 특히 glycoside 형태보다는 aglycone이 보다 우수한 항산화할성을 나타내었으며, L-ascorbic acid ($IC_{50}$=75.7㎍/ml) 와 비교하여 항산화능을 가진 화합물을 탐색한 결과 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane (4) ($IC_{50}$=76.0㎍/ml), hirsutenone (8) ($IC_{50}$=65.0㎍/ml)이 L-ascorbic acid와 비교하여 비슷하거나 더 좋은 효과를 나타내었다.
간보호활성에서는 오리나무수피의 diaylheptanoid 성분 중 주성분 화합물로 판단되는 oregonin (6) 에 대하여 Sylimarin과 비교한 TBARS 법에 의한 항산화 활성을 측정하였다. PLO 측정법에서 1㎍/ml에서 용량의존적인 항산화활성이 발견되었으나 LDH 측정에서는 0.1㎍/ml이상에서부터 간세포 독성을 나타내었다.
NO 생성억제실험에서는 diarylheptanoid 성분 모두 농도 의존적인 억제효과를 보였고, 특히 oregonin (6) 이 가장 좋은 효과를 보였고, 비교약물인 L-MNNA 2mM(22.8㎍/ml)와 비교하여 5㎍/ml(21.5㎍/ml), 10㎍/ml(19.5㎍/ml), 20㎍/ml(19㎍/ml), 40㎍/ml(17.9㎍/ml) 모든 농도에서 좋은 효과를 보였다($IC_{50}$=16.7㎍/ml). 그리고 40㎍/ml에서는 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane (4)(22.5㎍/ml), hirsutanonol (7)(22.8㎍/ml), hirsutenone (8)(19㎍/ml) 가 좋은 효과를 나타내었다.
RAW 264.7 cell에서 IFN-γ 및 LPS를 이용 COX-2 enzyme을 발현시키고 외부에서 arachidonic acid를 가하여 PGE2의 생성정도를 측정하는 방법으로 COX-2 activity를 측정한 결과 diarylheptanoid 모두 농도 의존적인 효과를 보였고, 비교약물인 Indomethacin ($IC_{50}$=26.1㎍/ml)보다 oregonin(6)($IC_{50}$=20.4㎍/ml), hirsutanonol (7)($IC_{50}$=24.9㎍/ml) 및 hirsutenone (8)($IC_{50}$=25.5㎍/ml)이 더 좋은 효과를 나타내었다.
Quinolone Reductase는 2상 효소계의 지표효소로서 다양한 종류의 암예방물질에 의해 활성이 유도되는 특성을 가지고 있어서 암예방물질의 탐색에 많이 사용되어 왔다. 10개의 diarylheptanoid를 검색한 결과 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane (4), oregonin (6), hirsutenone (8), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane-3-O-β-D-xylopyranoside (9) 가 농도 의존적인 효과를 보였고, 용매대조군 1과 비교하였을 경우 40㎍/ml에서 대조군에 비해 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane (4)가 1.39배, 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane-3-O-β-D-xylopyranoside (9) 가 1.43배로 다른 화합물 보다 우수한 활성을 나타내었다.
한편 가장 최적의 대량분리 조건을 확인하고자 실험하였으며 Alnus속 식물로부터 diarylheptanoid를 대량생산 할 수 있는 시스템을 구축하였다.
Extraction(추출)에 있어서는 Plant Material을 건조하고 분쇄(powder)하여 함수 Acetone으로 실온 추출하거나 함수 EtOH로 가온추출 하고, Fractionation(분획)단계에서는 Sephadex LH 20($H_{2}O$→MeOH)으로 분획하며, Isolation(분리)단계에서는 Chromatographic gel을 통한 분리하되, MCI-gel($H_{2}O$→MeOH)로 처리후 Sephadex LH 20(60% MeOH 또는 80% EtOH)로 진행하는 것이 가장 효과적임을 파악하였고, 추가로 ODS-gel(40% MeOH) 및 Toyopearl HW 40F($H_{2}O$→MeOH)를 사용함이 바람직함을 확인하였다.

Abstract ▼

To develop cancer chemopreventive agent from Alnus species, we isolated diarylheptanoids from the bark of Alnus japonica and evaluated its biological activities for anti-tumor promoting agent and prepared mass production system.
The bark of Alnus japonica was investigated chemically and 10 diaryl

To develop cancer chemopreventive agent from Alnus species, we isolated diarylheptanoids from the bark of Alnus japonica and evaluated its biological activities for anti-tumor promoting agent and prepared mass production system.
The bark of Alnus japonica was investigated chemically and 10 diarylheptanoids were isolated. Structures of these compounds were identified as 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-3-O-β-D-glucopyranosyl(1→3)-β-D-xylopyranosie (1), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-3-O-β-D-apiofuranosyl(1→6)-β -D-glucopyranoside (2) ,1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-5-O-β-D-glucopyranoside (3), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptan (4), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-3-one-5-O-β-D-glucopyranoside (5), oregonin (6), hirsutanonol (7), hirsutenone (8), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane-3-O-β-D-xylopyranoside (9) 및 platyphylloside (10) by comparisons with previously reported spectral data. Compound 1 and 10 were novel diarylheptanoids.
In MTT assay, the cytotoxic activity of 10 diarylheptanoids on mouse melanoma cell line were evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazalium bromide(MTT) colorimetric method. Oregonin (6), hirsutanonol (7), hirsutenone (8), platyphylloside (10) show significant cytotoxic activities. Hirsutanonol (7), platyphylloside (10) in stomachic cancer cell-line, hirsutanonol (7), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane-3-O-β-D-xylopyranoside (9) in hepato celluar carcinoma cell-line and irsutanonol (7), platyphylloside (10) in coloretal adenocarcinoma cell-line showed strong cytotoxic activities.
In DPPH assay, aglycones 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane (4), hirsutanonol (7) and hirsutenone (8) and mono glycosides 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-5-O-β-D-glucopyranoside (3), Oregonin (6) and 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane-3-O-β-D-xylopyranoside (9) showed more strong antioxidative activities than diglycosides 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-3-O-β-D-glucopyranosyl(1→3)-β-D-xylopyranosie (1), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-heptane-3-O-β-D-apiofuranosyl(1→6)-β -D-glucopyranoside (2) against the DPPH radical. Especially, 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptan (4) and hirsutenone (8) showed superior activity among ten diarylheptanoids.
In hepatoprotective assay, oregonin (6) showed anti-oxidative activity compared with sylimarin in TBARS method. oregonin (6) 1㎍/ml showed concentration dependent anti-oxidative activity in PLO method. but, oregonin (6) above 1㎍/ml showed a hepatic toxic activity in LDH measured.
In NO inhibition assay, Oregonin (6) showed lower NO content 5㎍/ml(21.5㎍/ml), 10㎍/ml(19.5㎍ /ml), 20㎍/ml(19㎍/ml), 40㎍/ml(17.9㎍/ml) than L-MNNA 2mM(22.8㎍/ml) and IC50 was 16.7㎍/ml. 1,7-Bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane (4)(22.5㎍/ml), hirsutanonol (7)(22.8㎍/ml), hirsutenone (8)(19㎍/ml) were strong NO production inhibitory activity in IFN-γ, LPS stimulated RAW 264.7 cell at 40㎍/ml.
In COX-2 inhibition assay, Oregonin(6) ($IC_{50}$=20.4㎍/ml), hirsutanonol (7)($IC_{50}$=24.9㎍/ml) and hirsutenone (8)($IC_{50}$=25.5㎍/ml) showed significant $PGE_{2}$ production inhibitory activity compared with Indomethacin ($IC_{50}$=26.1㎍/ml) in IFN-γ, LPS stimulated RAW 264.7 cell.
In quinone reductase assay, 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane (4), oregonin (6), hirsutenone (8), 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane-3-O-β-D-xylopyranoside (9) showed concentration dependent QR induction on HepG2 cells. Especially, 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxyheptane (4) and 1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl) -5-hydroxyheptane-3-O-β-D-xylopyranoside (9) showed higher activities than other compound compared with DMSO in 40 ㎍/ml. We also prepared the mass production system of diarylheptanoids from Alnus species.
These results suggested that the diarylheptanoids from the barks of Alnus. japonica might be daveloped as potential cancer chemopreventives.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 11
• 3. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 26
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 34
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 36
• 6. 첨부서류 ... 37
• 7. 참고문헌 ... 38