초록 ▼

현대인은 질병이나 사고 등에 의하여 구강내 연조직 손실을 가져오는 경우가 많다. 이러한 연조직의 손상을 치료하기 위하여 피부조직 자가이식이 행해지고 있다. 그러나 조직 공여부의 심한 상처를 남기게 되므로 조직의 자가이식을 대체할 상피세포배양을 통한 자가이식을 시도할 필요가 제기되고 있으나 상피세포 이식치료효과를 증명할 기본적인 연구가 없는 실정이다. 본 연구는 구강점막 상피세포 배양에 가장 적합한 배양 조건을 확립하고 상피세포를 이식할 때 재생효과를 분석할 수 있는 적합한 실험 모델을 확립하고자 하였다.
연구방법으로 구강점막

현대인은 질병이나 사고 등에 의하여 구강내 연조직 손실을 가져오는 경우가 많다. 이러한 연조직의 손상을 치료하기 위하여 피부조직 자가이식이 행해지고 있다. 그러나 조직 공여부의 심한 상처를 남기게 되므로 조직의 자가이식을 대체할 상피세포배양을 통한 자가이식을 시도할 필요가 제기되고 있으나 상피세포 이식치료효과를 증명할 기본적인 연구가 없는 실정이다. 본 연구는 구강점막 상피세포 배양에 가장 적합한 배양 조건을 확립하고 상피세포를 이식할 때 재생효과를 분석할 수 있는 적합한 실험 모델을 확립하고자 하였다.
연구방법으로 구강점막 각화상피세포를 이용하여 배양의 최적조건을 알기 위하여 NIH3T3 세포를 이용한 feeder layer 에서의 일차배양과 KGM 배지의 Ca 농도별로 배양을 비교하여배가시간과 FACS를 통한 cell cycle을 관찰하였다. 상피재생의 최적 실험조건을 확립하기 위하여 누드마우스 등에 다양한 크기의 상처를 만들어 critical size를 확립하였다. 누드마우스에 한 군은 구강점막 각화상피세포를 처리하고, 다른 군은 처리하지 않은 후 3일, 1주, 2주째 희생하여 생검한 후 조직학적 관찰과 면역화학적 관찰을 시행하였으며, cytokine 발현을 관찰하기 위하여 western blotting으로 KGF, IL-1, IL-6 발현을 관찰하였다. 세포 수에 따른 상처치유 효과를 관찰하기 위하여 $10^{3},\;10^{4},\;10^{5},\;10^{6}$세포 수의 구강점막 각화상피세포를 이식한 후에 조직학적 관찰을 통해 상피재생을 관찰하였다.
연구 결과는 다음과 같다.
1. 구강점막 각화상피세포를 다양한 조건에서 일차배양한 결과, 0.15mM $Ca^{2+}$ 농도의 KGM 배지에서 최적의 배양조건을 나타내었다.
2. 상처치유 재생효과를 관찰하기 위한 critical size는 1.5 x 1.5cm 이었다.
3. 구강점막 각화상피세포를 이식하지 않은 군보다 이식한 각 군에서는 3일, 1주, 2주로 갈수록 재생되는 상피층의 길이가 증가하였으며, 이식한 군에서는 2주에 완전한 재생을 보였고, 이는 정상 피부 조직과 유사한 소견을 보였다.
4. 창상 재생에서 KGF, IL-a, IL-6의 영향을 보기 위해 western blotting한 결과, 대조군에 비해 실험군에서는 cytokine의 발현이 높은 것을 관찰하였다.
5. 세포 수에 따른 상처치유 효과를 관찰한 결과, $10^{5}$ 까지 세포수를 증가시킴에 따라 재생 효과가 계속적으로 증가하였으나, 그 이상의 세포수에서는 증가 속도가 둔화되었다.
이상의 결과에서 구강점막 각화상피세포의 최적 배양조건을 확립하였으며, 이 조건하에서 배양된 구강점막 각화상피세포의 이식은 상피재생에 효과적이었고, 이는 자가이식을 통한 창상치유에 큰 효과를 나타낼 것으로 기대된다.

Abstract ▼

The reconstruction of oral innate deficiency and maxillofacial surgical defects has been a primary target for regenerative medicine. The acceleration of wound healing in oral mucosa has been widely investigated, because of its high tune-over rate.
The aim of the study was to pursue the culture co

The reconstruction of oral innate deficiency and maxillofacial surgical defects has been a primary target for regenerative medicine. The acceleration of wound healing in oral mucosa has been widely investigated, because of its high tune-over rate.
The aim of the study was to pursue the culture condition and wound healing effect of primary cultured oral mucosal keratinocytes and to assess their roles in skin wounds.
The culture condition of primary cultured oral mucosal keratinocyte was compared feeder layer culture with various Ca concentrated KGM media. Athymic nude mice were divided into control(none treatment) and experimental groups(oral mucosal keratinocyte treatment). Primary cultured oral mucosal keratinocytes were grafted onto 1.5X1.5cm sized full thickness skin defects in experimental groups. No graft was done onto defects in control groups. Both groups were sacrificed after 3rd days, 1 week and 2 weeks respectively. Biopsy specimens were taken from the defect areas and the histologic findings were examined to evaluate the healing process. The cytokine effects of cultured cells were assessed with western blotting with fibroblast growth factor 7 (FGF-7), acute proinflammatory cytokines interleukin-1a, 6(IL-1a, IL-6). Additionally we investigated the wound healing effect followed by the cell numbers grafted to bound by histological observation.
The result are followed
1. The most appropriate culture condition for oral mucosal keratinocytes was 0.15mM $Ca^{2+}$ supplemented KGM medium.
2. The critical size of reepithelization is 1.5 X 1.5 cm.
3. When grafted with oral keratinocytes, reepithelialization of the wound areas was completed in 2 weeks.
4. Western blotting showed that an approximately 1.6-fold increase of cytokine expression in experimental groups than the control. FGF-7 increased by 1st day and peaked by 3rd days after injury. IL-1α speedly increased at 3rd days and peaked 1weeks. iL-6 peaked by 2nd days and gradually decreased.
5. When grafted culture condition, the lengh of reepithelization was parallel to the cell number by the level of $10^{5}cells$. But more than $10^{6}cells$ keep steady reepithelization.
This study provides the evidence that the suspended primary cultured oral mucosal keratinocytes were capable of reepithelialization and were regulated by the paracrine factors.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 3
• 목 차 ... 4
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 6
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 7
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 10
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 17
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 19
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 23
• 최종보고서 비공개 승인요청서 ... 25