초록 ▼

고밀도지단백질 (HDL)은 고지혈증 및 심혈관질환을 개선, 치료하는 효과가 우수한 것으로 보고되어져 왔지만, 아포지백질 A-II (apoA-II)는 심혈질환 유발인자의 하나로 인식되고 있다. HDL 중에도 입자 크기가 감소된 HDL은 무익하며 고지혈증의 원인이 된다. HDL의 유익성은 LDL과의 상호작용, 혹은 apoA-II의 활성에 의해 상실될 수 있으며, 이때 HDL의 입자 크기는 감소하게 된다. 따라서 HDL의 유익성을 보존하고, 고지혈증의 개선을 위해서 apoA-II의 활성저해제, 혹은 LDL과의 상호작용 억제제를 개발하는

고밀도지단백질 (HDL)은 고지혈증 및 심혈관질환을 개선, 치료하는 효과가 우수한 것으로 보고되어져 왔지만, 아포지백질 A-II (apoA-II)는 심혈질환 유발인자의 하나로 인식되고 있다. HDL 중에도 입자 크기가 감소된 HDL은 무익하며 고지혈증의 원인이 된다. HDL의 유익성은 LDL과의 상호작용, 혹은 apoA-II의 활성에 의해 상실될 수 있으며, 이때 HDL의 입자 크기는 감소하게 된다. 따라서 HDL의 유익성을 보존하고, 고지혈증의 개선을 위해서 apoA-II의 활성저해제, 혹은 LDL과의 상호작용 억제제를 개발하는 것이 필요하고, 먼저 검색체계를 확립하기 위해, 본 연구과제에서는 대장균 발현체계를 통해 apoA-I 과 apoA-II를 성공적으로 생산하였고, 분리 apoA-I과 apoA-II 단백질을 사용하여, apoA-I으로는 재조합 고밀도 지단백질(reconstituted HDL)을 합성하고, apoA-II를 첨가하였다. apoA-II (lipid-free)는 5 kDa의 Histidine tag을 가지므로 전체 크기는 13 kDa 이고, 이 단백질을 토끼에게 주사하여 항체를 생산하였다. ApoA-II와 apoA-I의 상호작용 저해물질을 선발하기 위해서 HDL particle rearrangement assay 체계를 확립하였다. 생리적으로 가장 유사한 인지질인 palmitoyloleoyl phosphatidylcholine (POPC) 으로 재조합 지단백질을 일정비율로 합성 (Molar ratio= POPC:cholesterol:apoA-I, 95:5:1)하고 lipid free 상태의 apoA-II를 첨가하여 특성 규명하였다.
합성된 rHDL은 97 Å 내외의 입자크기를 가지며 혈청으로부터 분리된 apoA-I으로 합성된 HDL과 기능적 차이점이 없음을 알 수 있었다. ApoA-II를 첨가하여 (Molar ratio=1:0.5) 합성하여도 입자의 크기에는 변화가 없었으나, 37 ℃에서의 입자 안정성은 약화된 것으로 나타났다.
HDL과 ApoA-II의 상호작용, HDL과 LDL의 상호작용을 조절하는 물질을 선발하기 위해 사람 혈장으로부터 초원심분리를 통해 분리된 LDL (0.015 mg, 8ul)과 apoA-I으로 합성된 POPC-rHDL (0.02 mg, 10 ul) 을 혼합하여 37 ℃에서 24시간 동안 반응시키면, 97 Å의 반응전 입자크기가 78 Å의 입자크기로 변하게 된다. 이상과 같이 확립된 HDL 및 LDL particle rearrangement assay에 본 연구진이 확보하고 있는 500여종의 저분자 물질들-플라보노이드 계열, 리그난 계열, 페놀릭 계열, 펩타이드 계열, 시클릭 펩타이드 계열의 화합물 등-을 농도 별로 처리하여 두 가지의 효과가 우수한 화합물을 선발하였다. 두 화합물 모두 cinammic acid 계열로 아미노산 유도체화합물이며, 각각 SL142, E27로 명명되었다. SL142 (FW=325)는 4-hydroxycinnamic acid에 phenyalanine의 방향족 그룹이 amide 결합으로 된 화합물이며, 같은 계열에 치환된 20여종의 아미노산 잔기들 중에서 가장 좋은 활성을 보이며, 이외에도 hydrophobic 한 잔기들로 치환되었을 때 상대적으로 우수한 활성을 보였다.
E27 (FW=477)도 이와 유사한 계열의 구조인 3,4-dihydroxy- hydrocinammic acid에 aspartic acid benzyl ester가 amide결합으로 된 화합물이다. 이들의 결과로 종합하여 볼 때 apoA-I의 hinge domain을 구성하는 아미노산 잔기와 반응할 수 있는 물질들은 hydroxycinnamic acid에 방향족 아미노산 잔기 혹은 음전하를 갖는 극성 아미노산 잔기일 것으로 예상 된다. 이들은 신규 화합물로서 추가 연구의 가치가 충분하고, 추가기능을 파악해본 결과 지단백질대사에 중요하게 관여하는 효소인 Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase (ACAT)의 활성을 저해하며, 특히 두개의 동위효소인 ACAT-1과 -2에 대해 유사한 저해 활성을 보여 주었다. 이들은 LDL의 항산화 효과가 강한 것으로 나타났는데 특히 E27은 SL142 나 양성대조군인 probucol의 처리에 비해서도 3배 이상의 좋은 항산화 활성을 보여 주었다. RAW264.7세포를 이용한 세포독성 및 안정성 테스트 결과 최종농도 50 μM/1x105 cell 처리까지 90%이상의 생존율을 보여 급성 세포독성은 없는 것으로 나타났다. 사람 간세포주에 SL142와 E27을 최종농도 100 μM이 되도록 72시간 동안 처리해본 결과 세포생장에 아무런 지장이 없었으며, 전체 RNA를 추출하여 Nothern blot을 실시한 결과 ACAT의 전사 조절에는 큰 영향이 없으나, E27의 경우 ApoA-I유전자 발현을 70% 증가시키는 것으로 나타났다. 단백질 수준에서의 발현량의 차이는 유의적으로 보이지 않았으나 E27의 처리군에서 apoA-I 의 발현량이 대조군에 비해 조금 더 늘어남을 알수 있었다.
본 연구 과제를 통해 확립된 apoA-II-apoA-I 상호작용 assay를 통해, 천연물자원, chemical library 으로부터 조절물질을 선발할 수 있는 시스템이 구축되었다. Assay를 통해 선발된 저해제들인 cinnamic acid 아미노산 유도체들 (SL142와 E27)은 in vitro에서 HDL의 기능 강화 및 LDL 항산화, ACAT의 저해기능을 가지는 것이 확인되었고, 세포모델 (hepG2) 에서 독성이 없고, apoA-I의 전사발현을 촉진하는 것으로 나타나, 후속연구를 통해 고지혈증/동맥경화증 치료를 후보물질로서 개발될 수 있는 가능성을 시사하고 있다.

Abstract ▼

The major functions of HDL-lipid binding and solubilization, cholesterol removal from peripheral cells, activation of lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT), are due, in large part, apolipoproteins (apo) A-I, the major protein component of HDL. Numerous reports have proved that various function

The major functions of HDL-lipid binding and solubilization, cholesterol removal from peripheral cells, activation of lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT), are due, in large part, apolipoproteins (apo) A-I, the major protein component of HDL. Numerous reports have proved that various functions of HDL is highly dependent on conformation of apoA-I, especially, rearrangement of HDL in the reverse cholesterol transport and interaction with a HDL receptors, scavenger receptor-BI (SR-BI) on cell surfaces. The virtue of HDL and apoA-I can be interrupted by interaction of apoA-II, especially a few of helix domain of apoA-II can be exchanged into apoA-I domain.
A series of cinnamic acid derivatives were synthesized and their biological abilities on lipoprotein metabolism were examined. Among the tested compounds, 4-hydroxycinnamic acid (L-phenylalanine methyl ester) amide (5) and 3,4-dihydroxyhydrocinammic acid (L-aspartic acid dibenzyl ester) amide (13) inhibited human acyl-CoA:cholesterol acyltransferase-1 and -2 activities with apparent IC50 around 60 and 95 μM, respectively. Compounds 5 and 13 also served as an antioxidant against copper mediated low-density lipoproteins (LDL) oxidation with apparent IC50= 52 and 3 μM, compound 5 and 13, respectively. Additionally, decrease of HDL-particle size under presence of LDL was inhibited by the compound 5 at 307 μM of final concentration. Treatment of the compound 5 or 13 did not influence normal growth of RAW264.7 without detectable cytotoxic activity from a cell viability test. These results suggest that the new cinnamic acid derivatives possess useful biological activity as an anti-atherosclerotic agent with inhibition of cellular cholesterol storage and transport by the both ACAT, inhibition of LDL-oxidation, HDL particle size rearrangement. Although the precise mechanism has not been elucidated, it has been well accepted that anti-atherogenic property of HDL is originated from several beneficial function including neutralization of lipopolysaccharide in blood stream and protection of LDL against oxidation. It has been hypothesized that the predominant presence of bigger HDL population in blood circulation can lead to prevent incidence of atherosclerosis and hypercholesterolemia via stimulation of reverse cholesterol transport.
In the current report, compound 5 and 13 could inhibit the decrease of HDL-particle size under presence of LDL through putative mechanism structure stabilization of apoA-I and enhancement of antioxidant activity of HDL. In the pharmacological view, the treated dosage of compound was relatively high as usual usage range of a pharmaceutical agent. However, in the biochemical viewpoint, the inhibition had a significant meaning that HDL-particle size rearrangement and/or hinge domain movement of apoA-I can be controlled by treatment of small compound. To our knowledge, this is the first investigation to screen a compound that can regulate interaction of LDL and HDL, and HDL-particle rearrangement. Further research is needed to elucidate more precise mechanism whether the compound interacts with apolipoproteins or phosphatidylcholines of the each lipoprotein. Another interesting function of the compounds is that they can inhibit ACAT-1 and -2 simultaneously. The isotypes of ACAT are differently found in many biochemical and biophysical characteristics; substrate binding efficiency, membrane topology, distribution of tissue location. ACAT-1 is found primarily in the Kupffer cells of the liver, kidney, and adrenal cortical cells, while ACAT-2 is mainly located in hepatocytes and intestinal mucosal cells. Furthermore, a few of ACAT inhibitors revealed that they have markedly different inhibitory activity and sensitivity against ACAT-1 and -2 depends on the structure and solubility. Therefore, it is generally accepted that an ACAT inhibitor should have simultaneous inhibitory activity to both isotype of ACAT to maximize therapeutic effect and pharmaceutical potency.
Taken together the others report and our current findings, it is necessary that in vivo test or preclinical evaluation of the compound using animal model to develop potent agent from the compound 5 and 13. They are expected to contribute treatment of hypercholesterolemia via stimulation of cholesterol excretion with their useful activities on lipoprotein metabolism and no cytotoxic effect.
Two amino acid derivatives of cinnamic acid, 4-hydroxycinnamic acid (L-phenylalanine methyl ester) amide and 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid (L-aspartic acid dibenzyl ester) amide, were identified as a regulator of HDL-particle rearrangement and inhibitor for ACAT-1 and -2. As well as their strong antioxidant activity, they can be a lead compound to develop an anti-atherosclerotic agent and blood lipd-lowering drug.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목 차 ... 4
• Ⅰ. 연구개발결과 요약문 ... 5
• (한글) ... 5
• (영문) ... 7
• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ... 9
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ... 13
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 14
• 2.1. apoA-I의 발현 ... 14
• 2.2. apoA-II의 클로닝 및 발현, 대량 분리 ... 15
• 2.3 apoA-II 항체 생산 ... 17
• 2.4. apoA-II와 apoA-I 상호작용 assay 물질 선발 ... 18
• 2.5. LDL과 apoA-I-rHDL 의 상호작용 assay ... 20
• 2.6. 선발된 화합물들 (compound 5 와 13)의 추가기능조사 ... 20
• 2.7. 세포독성조사 ... 24
• 2.8. 사람세포내에서의 유전자 발현조절효과 ... 25
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 28
• 3.1. 연구결과 고찰 ... 28
• 3.2. 결 론 ... 28
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당함) ... 29
• 4.1. 사업화 목표 달성도 ... 29
• 4.2. 사업화 수준(계획 및 완료 포함) ... 29
• 4.3. 사업화 우수성 ... 29
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 30
• 5.1 총괄연구개발과제의 연구결과 ... 30
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 45
• 6.1 기술적 파급효과 ... 45
• 6.2 경제적 파급효과 ... 45
• 6.3 사회적 파급효과 ... 45
• 7. 첨부서류 ... 46
• 8. 참고문헌 ... 51