초록 ▼

◈ 연구목적:
저산소 자극에 의해 유도되는 신경세포 손상 과정에서 미토콘드리아의 역할을 규명하고 미토콘드리아 손상 과정에 관여하는 단백질을 규명하여 저산소증에 의한 신경세포 손상을 기전을 밝힘
▸ 1차년도 연구목표
저산소 자극에 의해 유발되는 괴사 및 delayed neuronal death에서 미토콘드리아의 역할규명
1) 저산소 자극에 의한 미토콘드리아의 형태학적 변화 규명
2) 저산소 자극이 미토콘드리아 permeability transition, 막전위에 미치는 영향 규명
3) 괴사 및 dela

◈ 연구목적:
저산소 자극에 의해 유도되는 신경세포 손상 과정에서 미토콘드리아의 역할을 규명하고 미토콘드리아 손상 과정에 관여하는 단백질을 규명하여 저산소증에 의한 신경세포 손상을 기전을 밝힘
▸ 1차년도 연구목표
저산소 자극에 의해 유발되는 괴사 및 delayed neuronal death에서 미토콘드리아의 역할규명
1) 저산소 자극에 의한 미토콘드리아의 형태학적 변화 규명
2) 저산소 자극이 미토콘드리아 permeability transition, 막전위에 미치는 영향 규명
3) 괴사 및 delayed neuronal cell death과정의 caspase 활성화 규명
4) caspase inhibitor가 미토콘드리아 permeability transition, 막전위에 미치는 영향 규명
5) Permeability transition 억제물질이 신경세포 손상 억제에 미치는 영향 규명
▸ 2차년도 연구목표
미토콘드리아의 형태학적, 기능적 변화를 유도하는 단백질 규명
1) 후보 단백질 선정 - BNip3, Adrenomedullin
2) 저산소 자극이 신경세포의 BNip3 발현 및 안정화(stabilization)에 미치는 영향 규명
3) BNip3의 발현이 미토콘드리아의 형태학적, 기능적 변화에 미치는 영향 규명
4) 저산소 자극이 BNip3의 세포내 분포에 미치는 영향 규명
5) BNip3 발현 억제가 신경세포 손상 억제에 미치는 영향 규명
저산소자극에 의해 유도된 활성산소가 caspase-9활성에 미치는 영향
1) 저산소 자극 활성산소가 미토콘드리아 permeability transition에 미치는 영향
2) 저산소 자극 활성산소가 cytochrome c 유리에 미치는 영향
◈ 연구방법:
1) 신경세포의 분리 및 저산소 자극 흰쥐에서 뇌를 적출한 후 신경세포를 분리한 후 neuronal basal media에서 배양한다. cytosine arabinoside를 처리하여 glial cell을 제거한다. 저산소 자극은 산소가 제거된 배지 상태에서 hypoxic chamber에 넣어 세포손상을 유도한다.
2) 미토콘드리아 막전위 측정 배지에 미토콘드리아 막전위를 반영하는 형광물질(mitotracker, rhodamine123)을 투여하여 10분간 방치한 후 PBS로 세척한 후 형광의 강도를 측정한다
3) apoptosis assay 세포사멸을 DAPI를 이용하여 핵을 염색한 후 형광현미경 하에서 핵의 형태학적 변화를 관찰한다.
4) caspase활성화 측정 caspase substrate를 이용하여 cleavage assay를 한다.
5) 면역 블롯
6) BNip3 overexpression 클로닝된 BNip3 cDNA를 adenovirus에 삽입하여 Ad-BNip3를 제작하여 신경세포에서 BNip3의 발현을 유도한다.
◈ 연구결과:
▸ 저산소증으로 인한 미토콘드리아 손상기전
저산소로 인한 미토콘드리아 손상과정에 caspase-9이 관여 한다.
1) 저산소 자극은 활성 산소의 증가를 초래하며, 증가된 활성 산소는 세포질에 존재하는 caspase-9의 활성화를 유도한다.
2) 활성화 된 caspase-9은 미토콘드리아 막에 일종의 pore를 형성한다.
3) Caspase-9에 의해 형성된 pore를 통하여 cytochrome c 가 유리된다.
4) 유리된 cytochrome c는 caspase의 활성화를 증폭시킨다.
5) caspase inhibitor는 저산소에 의한 미토콘드리아 손상을 억제한다.
▸ 미토콘드리아 변화를 유도하는 단백질 규명
1) BNip3의 과 발현은 신경세포 사멸을 유도한다.
2) BNip3의 과 발현은 미토콘드리아 막전위를 소실시킨다.
3) BNip3의 발현 억제는 저산소 자극으로부터 신경세포 손상을 억제한다.
4) 저산소 자극은 BNip3의 미토콘드리아 삽입을 유도한다.
5) Adrenomedullin은 저산소 자극으로부터 신경세포를 보호한다.
6) Adrenomedullin은 저산소 자극으로부터 미토콘드리아 막전위 소실을 억제한다.
7) Adrenomedullin은 저산소 자극으로부터 glutathione의 감소를 억제한다.
8) Adrenomedullin은 저산소 자극으로부터 미토콘드리아 cytochrome c 유리를 억제한다.
▸ 결론
저산소증으로 인한 세포손상 과정에서 미토콘드리아는 caspase 의존적으로 cytochrome c를 유리하여 세포사멸의 진행을 유도한다. 또한 이 과정에서 BNip3는 미토콘드리아 손상을 유도하고 adrenomedullin은 미토콘드리아의 막전위 소실 및 cytochrome c 유리를 억제함으로써 신경세포를 보호한다.

Abstract ▼

◈ Purposes of Research
1. Clarify the roles of mitochondria in hypoxic neuronal death
2. Identify the molecules responsible for mitochondrial changes in hypoxic cell death
◈ Methods used in this work
1. Isolation of neuron cells from rat brain
2. Hypoxic stimulation using 0.5% O2 in h

◈ Purposes of Research
1. Clarify the roles of mitochondria in hypoxic neuronal death
2. Identify the molecules responsible for mitochondrial changes in hypoxic cell death
◈ Methods used in this work
1. Isolation of neuron cells from rat brain
2. Hypoxic stimulation using 0.5% O2 in hypoxia chamber
3. Apoptosis assay using DAPI under fluorescence microscope
4. Caspase cleavage assay using colorimetric caspase substrate
5. Determination of mitochondrial membrane potential using potential-sensitive Mitotracker by flow cytometry
6. Western blot
7. BNip3 overexpression by transient transfection of BNip3 plasmid
8. Suppression of BNip3 suppression by anti-sense oligonucleotides
◈ Results
1. Caspase-9 activation induced by reactive oxygen species is responsible for mitochondrial deterioration in hypoxic cell death.
2. Inhibition of caspase activation rescues cells from hypoxic injury.
3. Overexpression of BNip3 induced mitochondrial catastrophe.
4. Suppression of BNip3 by anti-sense oligonucleotides protected cells from hypoxic death.
5. Adrenomedullin protected cells from hypoxic assaults
6. Adrenomedullin inhibits loss of mitochondrial membrane potential induced by hypoxia.
7. Adrenomedullin inhibits cytochrome c release from mitochondria.
8. Adrenomedullin rescues cells from hypoxia by maintaining cellular glutathione levels.
9. Adrenomedullin modulates activity of glutathione peroxidase.
Finally, early activation of caspase-9 is responsible for mitochondrial catastrophe induced by hypoxia.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• Ⅰ. 연구개발결과 요약문 ... 5
• (한글) ... 5
• (영문) ... 7
• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ... 8
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ... 9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 10
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 21
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 22
• 5.1 총괄연구개발과제의 연구결과 ... 22
• 7. 첨부서류 ... 27