보고서 정보
주관연구기관 |
광주과학기술원 Gwangju Institute of Science and Technology |
연구책임자 |
안주홍
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2005-05 |
과제시작연도 |
2004 |
주관부처 |
보건복지부 |
과제관리전문기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201300001969 |
과제고유번호 |
1460004116 |
사업명 |
보건의료기술연구개발(보건의료기술인프라개발) |
DB 구축일자 |
2013-05-20
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키워드 |
예쁜꼬마선충.다운증후군.Down syndrome.DSCR1.rcn-1.C. elegans.
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초록
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연구개발의 목적
본 연구 과제의 최종목표는 선충류인 C. elegans를 모델동물로 하여 calcineurin의 조절 단백질의 family에 속하는 DSCR1(Down Syndrome Critical Region 1) / MCIP(Modulatory Calcineurin Interacting Protein 1)1의 기능연구와 이를 통한 개체수준에서의 질병연구 모델을 제시하고자 한다.
[ 제1차년도 (2003. 5 - 2004. 4) ]
연구목표: rcn-1 유전자의 발현 시기와 부위를 밝혀 calcineurin 유전
연구개발의 목적
본 연구 과제의 최종목표는 선충류인 C. elegans를 모델동물로 하여 calcineurin의 조절 단백질의 family에 속하는 DSCR1(Down Syndrome Critical Region 1) / MCIP(Modulatory Calcineurin Interacting Protein 1)1의 기능연구와 이를 통한 개체수준에서의 질병연구 모델을 제시하고자 한다.
[ 제1차년도 (2003. 5 - 2004. 4) ]
연구목표: rcn-1 유전자의 발현 시기와 부위를 밝혀 calcineurin 유전자의 발현 양상과 비교하고, C. elegans 개체 내에서의 rcn-1유전자의 과발현을 통해, calcineurin 돌연변이 표현형을 재현한다.
연구방법: * GFP reporter system, Microinjection을 통한 발현양상 분석
* human DSCR1에 대한 항체를 통해 단백질 수준에서의 발현양상 분석과 rcn-1 의 진화적 보존의 확인
* rcn-1 유전자의 과발현을 통한 기능 분석.
[ 제2차년도 (2004. 5 - 2005. 4) ]
연구목표: calcineurin의 조절단백질로서의 기능과 관련 유전자들과의 연관관계를 돌연변이 를 통하여 확인하고, 신경세포 특이적인 promoter를 이용한 rcn-1유전자의 과발현을 통해서 Down Syndrome의 병리학적 특징을 재현한다.
연구방법: * C. elegans 돌연변이를 이용한 rcn-1 유전자의 기능 분석
* 다양한 C. elegans 돌연변이에서의 rcn-1 유전자의 과발현.
* rcn-1 유전자가 과발현된 worm을 다양한 stress 유발물질에 노출 시켜서
Down Syndrome의 병리학적 특징을 재현.
연구결과:
1. GFP를 이용한 유전자 발현 양상의 분석: rcn-1의 GFP는 늦은 시기의 embryo에서부터 성체까지 여러 신경세포를 포함한 다양한 종류의 세포에서 발현. 대부분의 부위가 calcineurin의 발현과 일치.
2. human DSCR1에 대한 항체를 통한 rcn-1의 단백질 수준에서의 발현양상: C. elegans rcn-1은 human DSCR1과 40%의 유사성을 가짐. human DSCR1 항체를 가지고 immunostaining을 한 결과 GFP를 통해 발현한 부위와 거의 일치함. 따라서 rcn-1은 진화적으로 보존되어 있음을 확인함.
3. rcn-1 유전자의 과발현을 통한 기능 분석: rcn-1이 과발현된 animal은 calcineurin의 기능을 잃어버린 돌연변이와 같은 매우 느린 성장과 발달, 작은 body size와 적은 brood size, 늦은 시기의 embryo를 낳는 egg-retention을 보임. rcn-1이 과발현 되면 생체내의 calcineurin의 활성이 저해를 받아서 calcineurin 기능을 잃은 돌연변이와 비슷한 표현형을 보여준 것으로 보임. calcineurin 활성과 연관된 표현형을 보기위해서 serotonin 5-HT를 가지고 실험.serotonin은 egg laying을 조절하는 근육의 이완에
의해 uterus내의 egg들이 체외로 나오게 하는데 rnc-1과발현의 경우도 cnb-1과 비슷한 저항성을 보임. gain-of-function cna-1의 경우는 hypersensitivity를 보임. cna-1에 rcn-1을 과발현 시키면 hypersensitivity를 저해하여 WT과 비슷한 수준으로 egg-laying 표현형을 회복함. 이 결과를 통해 serotonin을 매개로 하는 egg-laying은 calcineurin phosphatase 활성에 의해 특이적으로 조절되며, calcineurin의 다양한 기능에서 rcn-1이 저해하는 효과를 보여준다고 볼 수 있음.
4. deletion mutant screening: 돌연변이를 유발시키는 물질들은 많이 알려져 있고 그들의 기작에 관하여서도 많은 연구가 되어 있어 본 과제의 목적에 맞는 돌연변이 유발물질을 사용하는 것이 중요하다. 보통 많이 쓰는 EMS(ethylmethanesulfonate)의 경우 돌연변이를 유발시키는 효율은 우수하나 대부분의 경우 G/C에서 A/T로 변환되는 돌연변이이기 때문에 적합하지 않고 TMP/UV를 이용하면 효율은 다소 낮지만 원하는 결손돌연변이의 확률이 높아진다고 알려져 있다. 따라서 본 연구진은 TMP/UV를 이용한 mutagenesis를 수행하였다. 현재까지는 위암관련 유전자로 예상되는 ppa-1에 대한 primer를 사용하여 mutant screening을 수행한 결과 ppa-1에 대한 deletion mutant를 찾아내었다.
Abstract
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1. The research aim: We suggest the function of calcineurin regulator, rcn-1, which is homologue of DSCR1(Down syndrome critical region 1/MCIP (Modulatory calcineurin interacting protein 1) and disease model in whole organism in C. elegans as an animal model.
2. The research methods:
1. rc
1. The research aim: We suggest the function of calcineurin regulator, rcn-1, which is homologue of DSCR1(Down syndrome critical region 1/MCIP (Modulatory calcineurin interacting protein 1) and disease model in whole organism in C. elegans as an animal model.
2. The research methods:
1. rcn-1 GFP expression analysis.: Microinjection of the GFP expression construct which contains 5' upstream promoter region was performed. After the stable transgenic line was obtained, worms were treated with 1% (w/v) levamisole to immobilize theanimals and GFP signals were observed by fluorescent microscopy (Olympus BX50).
2. rcn-1 overexpression analysis: High concentrations of overexpression construct (500 ng) was co-injected with 50 ng of construct which contains 5' upstream promoter region and GFP as a GFP marker into both N2 and cna-1(jh107) mutant animals, and stable transgenic lines were obtained. N2 transgenic animals displaying both strong GFP expression and a slow growth phenotype (approximately six days from hatching to adulthood) were collected for phenotype analysis. Brood size and one-day adult worm body size were measured. Serotonin-mediated egg laying was measured. Briefly, one-day adult worms were immersed into a control M9 solution or a 12.5 mM serotonin (5-HT) solution (Sigma) for 90 minutes, after which the number of eggs laid by each worm was counted. Transgenic cna-1(jh107) animals displaying strong GFP expression were picked for phenotypic analysis.
3. The results:
1. rcn-1 gene expression: we examined the temporal and spatial expression of rcn-1 in C. elegans. A 3.1 kb fragment comprised of rcn-1 genomic DNA from the 5' upstream promoter region and a portion of exon 1 was fused to green fluorescent protein (GFP) and transformed into C. elegans. GFP analysis of the transformed animals revealed that rcn-1 is expressed from late embryonic stages to adulthood in diverse tissues, including lateral hypodermal cells, marginal cells of the pharynx, vulva epithelial cells, ventral and dorsal nerve cords and commissures, and various neurons in the anterior and posterior portions of the worm. Male C. elegans displayed rcn-1 expression in male tail structures including the diagonal muscles, sensory rays, and spicules. GFP expression analysis of a shorter 1.6 kb 5' upstream fragment of rcn-1 revealed vulva muscle expression in addition to the aforementioned expression patterns. Most of the tissues expressing rcn-1 overlap with those observed in calcineurin GFP and by immunostaining, including lateral hypodermal cells, vulva muscle tissue, nerve cords, and diverse neuronal expression.
2. RCN-1 overexpression analysis: Since RCN-1 can bind directly and inhibit calcineurin phosphatase activity, we wanted to know whether RCN-1 could inhibit in vivo functions in C. elegans that are dependent on calcineurin signaling pathways. Loss of the regulatory subunit calcineurin B in cnb-1(jh103) null mutants leads to a complete loss of calcineurin function, resulting in animals with multiple phenotypes, including defects in growth, fertility, cuticle development, and egg laying. Thus, we tested whether overexpression of RCN-1 could induce defects observed in calcineurin mutants by in vivo inhibition of calcineurin activity. We designed the construct that contains the full rcn-1 coding region whose expression is controlled by the calcineurin A upstream regulatory region and injected this construct into C. elegans. We examined the transgenic lines for possible phenotypes caused by RCN-1 overexpression under the control of the calcineurin A promoter. Worms that displayed strong GFP marker expression and, thus, were likely to express the co-injected construct at high levels were picked and phenotypes were assessed. These animals showed very slow growth and development compared to wild-type animals often reaching adulthood about six days after hatching. This worms exhibit significantly smaller body sizes and brood sizes, similar to that of calcineurin mutants. In addition, the adult transgenic animals showed an egg-retention phenotype characterized by laying of late-stage embryos, an a clear cuticle phenotype in which worms display a transparent appearance. These defects were observed in calcineurin loss-of-function mutants, suggesting that overexpression of RCN-1 could inhibit endogenous calcineurin activity and emulate calcineurin loss-of-function phenotypes in C. elegans. To further confirm whether the observed phenotypes are related to calcineurin activity directly, we treated wild-type, calcineurin mutant, and RCN-1 transgenic animals with the neurotransmitter serotonin 5-HT. Serotonin is known to excite vulva muscle endogenously, and exogenous treatment of serotonin to C. elegans leads to spontaneous egg laying. Calcineurin was shown to be involved in a signaling pathway that regulates egg laying, and cnb-1(jh103) mutants displayed resistance to serotonin-induced egg laying. Treatment of this worms with serotonin resulted in resistance similar to that of cnb-1(jh103) mutants.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- Ⅰ. 연구개발결과 요약문 ... 5
- (한글) ... 5
- (영문) ... 7
- Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 17
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 23
- 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당) ... 24
- 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 24
- 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 40
- 7. 참여연구원 편성표(총괄) ... 40
- 8. 첨부서류 ... 40
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