초록 ▼

본 연구에서는 수정결정전극에서 질량축적에 의한 진동수변화의 원인이 항원․항체반응에서 볼 수 있는 것과 같은 receptor-ligand complex의 형성이 아닌 cholinesterase(ChE)의 반응기질이 분해될 때 생성되는 반응산물의 용해도가 감소하고 그 결과 센서 chip상에 침전이 부착되는 특징을 이용하여 유기인계 및 카바메이트계 농약에 대한 새로운 간이검출기술 개발을 목표로 한다.
이를 위하여 먼저 ChE-quartz crystal microbalance(ChE-QCM) 바이오센서 시스템을 금전극이 증착된 박막수

본 연구에서는 수정결정전극에서 질량축적에 의한 진동수변화의 원인이 항원․항체반응에서 볼 수 있는 것과 같은 receptor-ligand complex의 형성이 아닌 cholinesterase(ChE)의 반응기질이 분해될 때 생성되는 반응산물의 용해도가 감소하고 그 결과 센서 chip상에 침전이 부착되는 특징을 이용하여 유기인계 및 카바메이트계 농약에 대한 새로운 간이검출기술 개발을 목표로 한다.
이를 위하여 먼저 ChE-quartz crystal microbalance(ChE-QCM) 바이오센서 시스템을 금전극이 증착된 박막수정결정과 holder, 발진모듈(oscillator circuit), 내장형 전원공급장치 및 GPBI interface가 부착된 진동수측정기(frequency counter), PC로 구성하였고, 시스템의 구동은 WinEchem software에 의하여 행하였다. 또한, 본 연구에서는 수정결정전극에 고정화된 ChE에 의하여 반응기질인 3-indolyl acetate가 분해될 때 형성되는 불용성 색소가 센서 chip에 침전화하여 수정결정전극의 질량변화를 유도하는 침전화 원리를 설정하였다. 이때 유기인계 및 카바메이트계 농약이 존재하면 효소활성이 저해되므로 침전의 생성량이 줄어들고 이 원리를 이용하여 해당농약의 정성 및 정량적 검출에 이용할 수 있다.
침전화 관련 효소로서 상용의 acetylcholinesterase(AChE)와 butyrylcholinesterase(BChE)를 사용하였으며 센서 chip으로 self-assembled monolayer(SAM)를 형성하는, ChE 고정화에 필요한 thiol화 가교화제, 3-mercaptopropionic acid와 cystamine과 같은 thiol 및 sulfide 화합물을 확보하였다. 실험결과 고정화효소로는 BChE보다 AChE의 경우 보다 양호한 센서반응을 나타내었으며 효소의 고정화방법 중 sulfosuccinimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate를 가교화제로 사용하는 thiol화 효소의 chemisorption과 5% cystamine을 사용한 glutaraldehyde 가교화의 경우 보다 우수한 고정화효율을 나타내었다. 센서계측의 최적화 실험을 행한 결과 고정화 효소농도를 5 units로 하고 반응 cell 내의 stirring time은 3분으로 조절하는 것이 가장 좋은 센서감응성을 나타내었으며 기질과의 반응성을 향상시키기 위하여 surfactant로서 0.01% Tween 80을 첨가하였고 센서반응 후 고정화 센서 chip에 부착된 불용성 침전을 dimethylformamide로 제거하면 반복사용이 가능하고 이 경우 5회 사용 후의 센서감응성은 초기에 비해 13% 정도 감소하였다.
본 연구에서 사용한 공시농약은 ChE에 의한 저해를 받는 유기인계 및 카바메이트계 농약이었으며 그 중 유기인계 농약으로 paraoxon-ethyl, chlorpyrifos, EPN과 카바메이트계 농약으로 carbofuran, carbaryl을 대상으로 하였다. 유기인계 농약은 기질과 비경쟁적으로 작용하므로 반응기질과 저해제로서의 농약을 함께 가하여 실험하나 카바메이트계 농약은 ChE의 결합부위에 대하여 반응기질과 경쟁적으로 작용하므로 효소고정화 센서 chip을 저해제로 preincubation 한 후 실험을 행하였다.
공시농약에 의한 AChE-QCM 바이오센서의 감응성 저해실험을 반응기질을 한 농도로 고정하고 행한 결과 농약농도가 증가함에 따라 효소저해율은 증가하는 경향을 보여주었으며, paraoxon-ethyl 3.63×$10^-^1^0$～3.63×$10^-^6$ M, chlorpyrifos 3.57×$10^-^8$～7.13×$10^-^5$ M, EPN 3.09×$10^-^9$～1.55×$10^-^4$ M, carbofuran 6.50××$10^-^1^0$～1.30×$10^-^5$ M, carbaryl 2.97×$10^-^9$～5.95×$10^-^5$ M의 농도범위에서 센서계측을 행한 결과 효소저해율은 7.23～69.54%로 나타났다. 또한, 수정결정상에 침전화된 효소반응산물을 제거하는 과정과 0.3634 μM paraoxon-ethyl에 의해 저해된 AChE를 재활성화 하기 위한 $10^-^3$ M 2-PAM 처리를 거친센서 chip을 6회 반복사용한 후의 효소저해율은 초기의 84.83%로 유지되었다.
AChE-QCM 바이오센서 계측과 아울러 속성분석법으로서의 분광광도법과 HPLC를 이용하여 시중 과채류 10종 안팎을 간단한 시료전처리를 행하여 분석용 검체(analytical sample)를 만든 후 임의농도의 대상농약을 첨가(spiking)하여 모델시료를 제조하고 그에 대한 비교분석을 행하였다. 그 결과 바이오센서 계측은 분광광도법, HPLC에 비하여 훨씬 검출한계(limit of detection, LOD)가 낮았으며 표준용액에 대한 상대저해율로 표시되는 검량선에의 수렴성도 양호하였다. AChE-QCM biosensor를 이용하는 경우 분광광도법보다 낮은 농도에서의 공시농약 검출이 가능한 것으로 나타나 이 방법을 저농도의 농약 검출에 적용할 수 있을 것으로 판단되며, 유기인계 및 카바메이트계 농약에 대한 간이검출법으로서 기존에 보고된 분광광도법을 보완하는 방법으로 본 연구결과의 바이오센서기술이 사용될 수 있을 것으로
여겨진다.
본 연구에서 확보된 연구결과를 향후의 잔류농약 신속검출에 손쉽게 적용할 수 있게 하기 위하여 실험방법 및 분석자료 획득과정을 protocol 형태로 작성하였고 개발된 기술의 홍보활용을 위하여 분석화학 분야의 권위있는 국제 conference인 PITTCON 2005에서 연구결과를 발표하였다.

Abstract ▼

A batch-type cholinesterase(ChE)-quartz crystal microbalance(QCM) biosensor for detecting organophosphorus and carbamate pesticides was developed. The operating principle of it is the inhibition in enzyme activity of the immobilized ChE over the QCM in the presence of a pesticide, resulting in a dec

A batch-type cholinesterase(ChE)-quartz crystal microbalance(QCM) biosensor for detecting organophosphorus and carbamate pesticides was developed. The operating principle of it is the inhibition in enzyme activity of the immobilized ChE over the QCM in the presence of a pesticide, resulting in a decrease in frequency shift upon the addition of a ChE substrate, 3-indolyl acetate, which is precipitated over the sensor surface upon enzyme hydrolysis.
For this purpose, the ChE-QCM biosensor system was constructed with a gold-sputtered quartz crystal and its holder, an oscillator circuit, a frequency counter attached with a GPBI interface and a PC. The system operation was conducted with WinEchem(version 1.12) software. To covalently bind ChE onto the gold electrode of QCM surface, 3 different immobilization methods comprising chemisorption of the ChE thiolated with a heterobifunctional cross-linker, sulfosuccinimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate, carboxyl-amine coupling of ChE to a thiol(3-mercaptopropionic acid) self-assembled monolayer(SAM) and glutaraldehyde crosslinking to cystamine SAM were tried, resulting in better sensitivity and binding efficiency in the case of the 1st and 3rd method. The analytical conditions for the biosensor were further optimized with respect to the surfactant concentration(0.01% Tween 80) in the reaction buffer, 0.1 M potassium phosphate(pH 8.0), the enzyme amount(5 units) and the substrate concentration(50 mg/mL). Compared to the immobilization of butyrylcholinesterase, that of acetylcholinesterase(AChE) showed better sensor responses. At the optimized conditions, the frequency shift amounting to 750 Hz was attained. The repeatability of biosensor response according to dimethylformamide(DMF) washing was reasonably good with the residual sensitivity around 87% after 5 repetitive measurements.
The pesticides of interest in this study were organophosphorus materials comprising paraoxon-ethyl, chlorpyrifos and EPN, and carbamate ones such as carbofuran and carbaryl. By measuring the inhibition degrees of the AChE-QCM biosensor with these chemicals, the concentrations of them can be determined qualitatively or quantitatively. As a carbamate pesticide competes with the substrate for the binding site of AChE, a pre-incubation of the sensor chip with it was required before determining sensor response in the presence of the substrate.
The inhibitions in sensitivity for the AChE-QCM biosensor were measured at various concentrations of the tested organophosphorus and carbamate pesticides ranging from 3.63×$10^-^1^0$ to 1.55×$10^-^4$ M at a fixed substrate concentration of 50 mg/mL, resulting in the enzyme inhibitions from 7.23 to 69.54%. As expected, the degree of enzyme inhibition increased in proportion to the rise in pesticide concentration. When the sensor chip was regenerated with DMF washing and $10^-^3$ M 2-PAM treatmenter after the inhibition with 0.3634 μM paraoxonethyl, it was repetitively usable with the enzyme inhibition amounting to 84.83% of the original one after 6 measurements.
The AChE-QCM biosensor developed was compared with a conventional spectrophotometric method for screening organophosphorus and carbamate pesticides, and HPLC for their analytical performance. For this purpose, the model samples spiked with the pre-determined amount of each pesticide were prepared from marketed fruits and vegetables after a sample pre-treatment, and were used for the comparative study. As an important finding, the limit of detection(LOD) for the biosensor was quite low compared to those of the spectrophotometric method and HPLC. The convergency to the calibration curve also was reasonably good. Considering its higher sensitivity, the current AChE-QCM biosensor might find an applicability to the screening of organophosphorus and carbamate pesticides which might be present in some fruits, vegetables and the products from them.
The experimental and data processing procedure for the biosensor technique developed were explained as a protocol for an easier application of the current method. For a dissemination of the obtained finding, the research output also was presented at PITTCON 2005 which is an authoritative international conference in the sector of analytical chemistry.

목차 Contents

• 표 지 ... 1
• 제 출 문 ... 3
• 목 차 ... 4
• 요 약 문 ... 5
• SUMMARY ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 19
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 80
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획 ... 80
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 81
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 87
• 7. 참여연구원 편성표(총괄) ... 88
• 8. 첨부서류 ... 89
• 9. 참고문헌 ... 89