보고서 정보
주관연구기관 |
고려대학교 Korea University |
연구책임자 |
박우준
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2010-12 |
과제시작연도 |
2010 |
주관부처 |
환경부 |
과제관리전문기관 |
한국연구재단 National Research Foundation of Korea |
등록번호 |
TRKO201300007387 |
과제고유번호 |
1345137490 |
DB 구축일자 |
2013-05-20
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초록
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(1) 환경정화용 LM 미생물의 환경안전성 관리기법 연구
1) 환경정화용 LM 미생물 제제의 국내외 현황조사
▶ 국내 토양 정화업에는 2009년 10월 1일 기준으로 총 117개 업체가 등록되어있음. (http://www.busan.go.kr/data/04_life/06/091001-3.pdf). 주로 서울 경기 지역에 환경 정화용 미생물 제제 생산업체가 집중되어 있음
▶ 환경 정화용 미생물 제제는 유류 오염 환경에 대한 정화와 농업오염 환경에 대한 정화에 많이 사용됨. 하지만 LM 미생물을 이용한
제제 관한
(1) 환경정화용 LM 미생물의 환경안전성 관리기법 연구
1) 환경정화용 LM 미생물 제제의 국내외 현황조사
▶ 국내 토양 정화업에는 2009년 10월 1일 기준으로 총 117개 업체가 등록되어있음. (http://www.busan.go.kr/data/04_life/06/091001-3.pdf). 주로 서울 경기 지역에 환경 정화용 미생물 제제 생산업체가 집중되어 있음
▶ 환경 정화용 미생물 제제는 유류 오염 환경에 대한 정화와 농업오염 환경에 대한 정화에 많이 사용됨. 하지만 LM 미생물을 이용한
제제 관한 연구는 부족한 실정이며, 이에 대한 검출 기법 연구기 필요함.
2) 국내 유통 환경정화용 미생물제제, 하수처리장, 공장폐수의 LM 미생물 유출여부 조사를 위한 시료 확보
▶ 환경정화용 미생물 제제는 총 10개의 제제를 확보하였음. 이들 제제는 크게 오염 환경 복원 제제와 농업 환경 개량에 사용되는 제제로 나눌 수 있음.
▶ 하폐수 시료를 확보하기 위해서 탄천 물재생센터와 중랑물재생센터를 방문하였으며, 이를 통해서 각각 4개씩의 시료를 확보하였음. 또한 서울 시내에 존재하는 하천의 시료를 4개 확보함.
(2) 환경 정화용 LM 미생물의 자연 생태계 모니터링 기술 개발
1) 배양법에 의한 잠재적 LM 미생물의 선택적 배양 기법 개발
▶ E.coli, P. putida, A. oleivorans 등의 다양한 균주를 통해, LM 미생물 검출의 최적화 기법을 마련 하고자 하였음.
▶ 다양한 기법 중에 MPN 기법을 일차적인 선별 기법으로 사용하는 것이 유용하다는 것을 알게 되었음. 또한 MPN 기법과 Multiplex PCR, Dot-blot 기법을 함께 사용하는 것이 LM 미생물 검출에 매우 유용함.
▶ LM 미생물 검출 위해서 발색 및 발광 유전자를 목표로 하였을 때는 MPN-PCR 또는 MPN-dot blot을 통해서 검출이 가능함.
▶ 환경 유래 유전자와 백터 유래 유전자 간의 구별을 위해여서 백터의 origin 유전자와 항생제 마커 유전자를 이용한 DGGE 와 유전자 염기서열 sequencing 등의 다각적인 접근을 통한 검출 기법이 필요함.
2) 환경정화용 LM 미생물 검출을 위한 specific primers 개발
▶ 검색어 확장으로 인해, 누락될 수 있는 벡터를 최소화 하였고, perl 언어를 사용한 개발 프로그램으로 수작업을 통해 발생할 수 있는 오류를 방지하였음.
▶ 각각의 항생제 저항성 유전자에 대해 tetracycline 3 group, ampicillin 5 group, chloramphenicol 3 group, kanamycin 2 group의 프라이머를 제작, 환경 시료에 적용함으로서 몇몇 프라이머 세트에서 항생제 저항성 유전자를 검출 할 수 있었음.
▶ 검출된 유전자의 염기서열을 조사해 본 결과, ampicillin group 2에서 6개중 1개의 유전자가 벡터의 염기서열과 상이함을 보였고, ampicillin group 4에서 17개중 8개, tetracycline group 2에서 18개중 0개, chloramphenicol group 1에서 2개중 0개, chloramphenicol group 3에서 10개중 8개의 유전자 염기서열이 벡터와 상이함을 보였음.
▶ 벡터의 유전자와 상이함을 보인 염기서열들에 대해서 blastx 검색을 실시한 결과, phosphoesterase, xylulose 분해효소, kinase등 비특이적으로 증폭이 일어난 유전자들의 정보가 나타났음.
▶ 하지만, hypothetical protein이나 protein of unknown function 의 경우 벡터의 염기서열과 상이함을 보였으나, 다른 유전자에 비해서, 조금 더 높은 상동성을 보임으로서, 현재까지 알려지지 않은 자연계 유래 항생제 저항성 유전자의 가능성을 보였음.
3) Microarray기법을 이용한 도입유전자 검출기법개발
▶ 유사한 염기서열을 가지는 두 tetracycline resistance type gene tetA와 tetC gene의 선별 검출이 가능함을 확인함.
▶ 환경시료의 microarray chip 적용결과 LM미생물 함유시료와 LM미생물 비오염시료 모두에서 target gene이 검출됨.
▶ LM미생물 제작에 이용되는 ori gene, 비항생제 유전자를 이용한 cDNA probe 연구가 필요함.
Abstract
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We investigated environmental safety-management and detection methods for living-modified (LM) microorganisms used in bioremediation. This work was designed to develop safety management of LM microorganisms in bioremediation and provide guidelines which will be produced through analysing research pa
We investigated environmental safety-management and detection methods for living-modified (LM) microorganisms used in bioremediation. This work was designed to develop safety management of LM microorganisms in bioremediation and provide guidelines which will be produced through analysing research papers, patents, and foreign LM microorganisms-safety management methods. Also, we will establish detection methods for potential LM microorganisms, various scientific and practical techniques will be generated. These detection methods along with safety management analysis will be presented to Ministry of Environment.
To develop ecosystem monitoring methods for LM microorganism in bioremediation, we studies on development of selective culture method. We investigated various detection methods for LM microorganism using various microorganism. Two methods [plates counting andmost-probable-number (MPN)] together with either multiplex-PCR or DNA dot blotswere compared using genetically modified Escherichia coli, Pseudomonas putida, and Acinetobacter oleivorans harboring an antibiotic resistance genewith extra gfp and lacZ genes as markers. Sequence alignments collected from Perl program and denaturing gradient gel electrophoresis analysis revealed that the routinely-employed gfp and lacZ marker genes differ from those genes in many sequenced genomes and insoil DNA. Thus, specific multiplex PCR primer sets for the detection of either the plasmid-based gfp or lacZ genes could be generated. In the plate-counting method, many antibiotic-resistant bacteria from a soil microcosm grew as a colony on the agar plate containing antibiotics. The multiplex-PCR verification of randomly-selected antibiotic-resistant colonies with specific primers proved ineffective. The MPN-multiplex PCR method and antibiotic resistant phenotype could be used successfully to detect LM microorganisms, although this method was quite laborious. The MPN-DNA dot blot method screened more cells at a time in a microtiter containing the corresponding antibiotics, and was shown to be more effective than other methods. Our data revealed that the MPN-DNA dot blot method could be a more efficient method to detect LM microorganisms in soil using specific probes. Therefore, MPN method could be further developed. After microbial growth in the MPN plates, Dot-blot method could be very effective to confirm the presence of target genes in LM microorganism.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 국립환경과학원 최종보고서 ... 3
- 제출문 ... 4
- 요약문 ... 5
- SUMMARY ... 11
- 목차 ... 15
- 1. 사업의 필요성 ... 16
- 1.1 사업의 배경 및 필요성 ... 16
- 2. 사업목표 및 범위 ... 17
- 2.1 환경정화용 LM 미생물의 환경안전성 관리기법 연구 ... 17
- 2.2 환경정화용 LM 미생물의 자연생태계 검출기술 개발 ... 17
- 3. 추진 체계 및 조사 내용 ... 18
- 4. 연구 방법 ... 19
- 4.1 시료 확보를 위한 문헌 조사 방법 ... 19
- 4.2 LM 미생물 검출 위한 최적화 방안 마련 연구 ... 19
- 5. 연구 결과 ... 33
- 5.1 환경정화용 LM 미생물의 환경안전성 관리기법 연구 ... 33
- 가. 환경정화용 LM 미생물제제의 국내외 현황 조사 ... 33
- 나. 국내 유통 환경정화용 미생물제제, 하수처리장, 공장폐수의 LM 미생물 유출여부 조사를 위한 시료 확보 ... 36
- 5.2 환경정화용 LM 미생물의 자연생태계 검출기술 개발 ... 46
- 가. 배양법에 의한 잠재적 LM 미생물의 선택적 배양기법 최적화 방안 마련 ... 46
- 나. 환경정화용 LM 미생물 검출을 위한 specific primers 개발 및 기타 효율성 높은 LM 미생물 검출기법 최적화 방안 마련 ... 57
- 다. Microarray-based gene detection 기법을 이용한 도입유전자 검출기법 최적화 방안 마련 ... 116
- 6. 목표대비 달성도 및 향후 연구계획 ... 127
- 7. 참고문헌 ... 159
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