초록 ▼

Hippo kinase(Hpo) pathway는 세포 분열을 억제하고 세포 사멸을 촉진하여 조직 크기를 일정하게 유지한다. 상피세포는 일정한 세포 수에 이르게 되면 세포간의 contact inhibition에 의해 분열이 멈추는데, 이를 통해 장기의 크기가 일정하게 유지된다. 초파리 등에서 잘 밝혀진 것이 이 contact inhibition에 의한 장기 크기의 조절에 Hpo pathway가 중요하다는 사실이다. Hpopathway에 문제가 생긴 초파리나 mouse의 장기는 그 크기가 비정상적으로 커진다. 즉 hpopathway는

Hippo kinase(Hpo) pathway는 세포 분열을 억제하고 세포 사멸을 촉진하여 조직 크기를 일정하게 유지한다. 상피세포는 일정한 세포 수에 이르게 되면 세포간의 contact inhibition에 의해 분열이 멈추는데, 이를 통해 장기의 크기가 일정하게 유지된다. 초파리 등에서 잘 밝혀진 것이 이 contact inhibition에 의한 장기 크기의 조절에 Hpo pathway가 중요하다는 사실이다. Hpopathway에 문제가 생긴 초파리나 mouse의 장기는 그 크기가 비정상적으로 커진다. 즉 hpopathway는 정상적으로 기능할 때 조직의 과다성장을 막는 발암 억제기전으로 작용하는 것이다. 이 pathway는 초파리 뿐 아니라 포유류에도 그 component 유전자들과 그들의 interaction이 비교적 잘 보존되어 있으며, 실제 암 환자들의 조직에서 이 pathway의 component 유전자인 mer, sav등의 homolog가 mutation되어 있음이 발견되기도 한다. 따라서 Hpo pathway는 암 생성 억제치료법의 target으로 이용할 수 있는 가능성이 크다.
최근 초파리 연구를 통해서 Hpo pathway가 세포 분열뿐 아니라 cell polarity 또한 조절할 수 있음이 알려졌으나, 그 분자수준에서의 조절 과정에 대해서는 연구된 바가 없다. 또한 Hpopathway의 주요 하위 유전자인 YAP, TAZ의 target으로 TEAD 전사조절인자가 알려졌으나 이외에도 다른 많은 target이 있을 것으로 생각된다. 또한 Fat, Crumb등의 세포막 수준에서의 상위 유전자가 알려졌으나, 어떤 기작을 통해 Hpo pathway를 조절하는지는 명확하지 않다. 이처럼 Hpo pathway는 임상적으로 매우 중요함에도 불구하고 주요 유전자들의 기능과 관계를 제외하고는 여전히 풀어야 할 질문이 많다.
이 연구에서 우리는 C. elegans의 LATS kinase homolog인 wts-1의 기능에 주목했다. wts-1이 망가진 돌연변이는 L1시기에 arrest되어 더 이상 발생하지 못하는데, 이는 exocytosis defect에 의해 intestine 세포의 polarity가 망가지기 때문임을 apical membrane marker인 ACT-5를 이용해 확인하였다. 또한 wts-1은 초파리나 포유류의 LATS kinase와 달리, 세포 분열이나 사멸을 조절하지 않고 cell polarity만 조절하는 것을 확인했다.
그리고 Forward genetic screening을 이용해 Yki의 C. elegans homolog인 yap-1과 TEAD 전사조절인자인 egl-44가 wts-1하위에서 기능함을 밝혔다. yap-1과 egl-44는 wts-1 돌연변이의 L1 arrest phenotype과 cell polarity defect를 모두 suppression하였다. 또한 WTS-1은 YAP-1과 결합하여 YAP-1이 핵과 세포막으로 가는 것을 막는다. 이는 Hpo pathway가 활성화되면 LATS kinase가 YAP을 인산화 시켜 핵으로 들어가는 것을 막는다는 다른 모델 동물에서의 결과와 같다. 이러한 결과는 C. elegans에도 Hpo pathway의 주요 유전자들의 homolog가 존재하며, 그들 간의 interaction 역시 잘 보존되어 있음을 보여준다.
알려진 Hpo pathway의 상위유전자 중 하나인 merlin의 C. elegans homolog인 nfm-1 돌연변이 역시 wts-1 돌연변이와 마찬가지로 cell polarity defect에 의한 L1 arrest phenotype을 보였다. 이러한 nfm-1 돌연변이의 phenotype 역시 Hpo pathway의 하위 유전자인 yap-1 돌연변이에 의해 억제되었다. 이는 C. elegans에도 nfm-1-wts-1-yap-1-egl-44로 이루어지는 Hpo pathway가 작동해 cell polarity를 조절함을 뜻한다. 또한 흥미롭게도 nfm-1 돌연변이에서 wts-1의 세포내 위치가 basolateral region으로 망가져 있음을 관찰했다. 다른 모델 동물에서 merlin이 Hpopathway의 상위유전자로 작동하나 어떠한 분자적 기전으로 어떤 유전자를 조절하는지는 잘 알려지지 않았는데, 이러한 관찰 결과는 nfm-1이 wts-1의 세포내 위치를 조절함으로써 wts-1 activity를 조절할 수도 있음을 암시한다.
또한 yap-1과 wts-1을 각각 bait로 이용한 Yeast Two hybrid screening을 통해 actin binding protein과 zip-3 전사조절인자와 같은 Hpo pathway에서 작동할 것으로 생각되는 새로운 유전자들을 밝혔고, RNAi screening을 통해 wts-1 돌연변이의 cell polarity defect를 억제하는 snap-29을 비롯한 8개의 exocytosis complex 유전자를 찾았다. yap-1과 egl-44가 전사조절 complex를 이뤄 특정 유전자의 발현을 조절함으로써 이 exocytosis complex의 기능을 조절할 것으로 생각할 수 있다.
이러한 연구결과를 통해 대표적인 모델 생물 중 하나인 C. elegans에도 Hpo pathway가 잘 보존되어 있으며, 특히 이는 exocytosis를 통한 세포내 trafficking을 조절하여 apical membrane의 integrity를 유지하여 장 세포의 polarity를 유지하는데 중요한 기능을 함을 밝혔다. 이는 Hpopathway가 cell polarity를 조절하는 분자적인 기전에 대한 중요한 단서를 제공한다.

Abstract ▼

Hippo kinase(Hpo) pathway is a major regulator of tissue size homeostasis via controlling cell proliferation and apoptosis. Epithelial cell normally arrest when they contact with other cells. With this contact inhibition mechanism, cell number and tissue size homeostasis are maintained. It is well k

Hippo kinase(Hpo) pathway is a major regulator of tissue size homeostasis via controlling cell proliferation and apoptosis. Epithelial cell normally arrest when they contact with other cells. With this contact inhibition mechanism, cell number and tissue size homeostasis are maintained. It is well known that Hippo/LATS pathway is important for tissue homeostasis through regulation of contact inhibition. Tissue which has defects in this pathway shows abnormal growth.
Hpo pathway is well conserved from drosophila to mammal. And it is reported that human epithelial cancer cell often has mutation in several component of Hpo pathway as like Mer and Sav. Therefore Hpo pathway is a potential and powerful target of anticancer therapy, and the significance of Hpo pathway in tumorigenesis has increased for last 20 years.
Recently, the roles of Hpo pathway in regulation of cellular polarity was reported, but molecular mechanism is not yet elucidated.
Although this Hpo pathway is important for tumorigenesis, which signal regulate activity of this pathway isn't well established. Recently, several molecules has been identified as upstream signal of Hpo pathway like Fat, transmembrane protein. However how these upstream molecules interact with other known components of hpo pathway is not yet clear. And it is also possible that there's another upstream signal which regulates hpo pathway.
What we focused on in this study is the function of wts-1, the sole C. elegans homolog of LATS kinase. wts-1 mutant arrests at their first larva(L1) stage because of its intestinal cellular polarity defects. This abolished cellular polarity results from exocytosis defects, not from endocytosis defects. And interestingly, wts-1 isn't involved in the control of cell proliferation and apoptosis.
Using forward genetic screening, we have identified yap-1 and egl-44, encoding C. elegans homolog of YAP and TEAD, respectively, as downstream genes of wts-1. yap-1 and egl-44 mutation suppress L1 arrest phenotype and cellular polarity defect phenotype of wts-1 mutant. We also confirmed that WTS-1 binds with YAP-1 and inhibits its nuclear localization. This all data suggest that core components of Hpo pathway and interaction among them are well conserved in C. elegans.
Worm which has mutation in nfm-1, C. elegans homolog of merlin, shows L1 arrest and intestinal cell polarity defect in common with wts-1 mutant. yap-1 mutation also suppress these defects of nfm-1. This all data suggest that core components of Hpo pathway and interaction among them are well conserved in C. elegans. Interestingly, WTS-1-GFP expresses abnormally in basolateral region of intestinal cells in nfm-1 mutant. Even though merlin is known to acts as upstream signal of LATS kinase, the molecular mechanism underlying this regulation isn’t clear. Our observation will give some clue to understand this mechanism.
And we found several candidate genes including actin binding protein and zip-3 transcription factor which interact with wts-1 and yap-1 using Yeast Two Hybrid screening. In RNAi screening, we also identified 8 exocytosis complex genes which can suppress cell polarity defects of wts-1 mutant.
Our data suggest that Hpo pathway which consists of nfm-1-wts-1-yap-1 is also conserved in C. elegans and involved in apical membrane integrity maintenance via regulating intracellular trafficking. It will contribute provide further understanding of molecular mechanism of Hpo pathway to regulate cell polarity.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 8
• 1) 연구대상 ... 8
• 2) 연구방법 ... 9
• 3. 연구과제의 연구개발결과 ... 11
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 21
• 5. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 24
• (1) 연구성과 총괄 ... 24
• (2) 연구성과 상세내역 ... 25
• (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 28
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 30
• (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 30
• (2) 연구 성과의 활용계획 ... 30
• 7. 참고문헌 ... 31