초록 ▼

연구의 목적 및 내용
펩티드의 서열분석과 단백질의 정량분석을 동시에 수행할 수 있도록 해 주는 질량분석기반 다중 동중체 표지물질을 개발한 것과 이를 이용하여 단백질의 정량분석을 고효율로 처리할 수 있는 전략을 수립하고 활용하는 것이 연구의 주 목적이다.
연구결과
유기합성, 질량분석, 생화학 팀의 협동연구를 통해 기존의 동중체 표지들에 비해 우수한 성능을 가지는 새로운 구조의 다중 동중체 표지물질들을 합성하고 이들을 활용하여 단백질의 동정 및 정량분석을 고효율, 고정확도로 수행하게 하는 기반을 확립하였다. 연구기간동안

연구의 목적 및 내용
펩티드의 서열분석과 단백질의 정량분석을 동시에 수행할 수 있도록 해 주는 질량분석기반 다중 동중체 표지물질을 개발한 것과 이를 이용하여 단백질의 정량분석을 고효율로 처리할 수 있는 전략을 수립하고 활용하는 것이 연구의 주 목적이다.
연구결과
유기합성, 질량분석, 생화학 팀의 협동연구를 통해 기존의 동중체 표지들에 비해 우수한 성능을 가지는 새로운 구조의 다중 동중체 표지물질들을 합성하고 이들을 활용하여 단백질의 동정 및 정량분석을 고효율, 고정확도로 수행하게 하는 기반을 확립하였다. 연구기간동안 총 4편의 논문(SCI급 저널 3편, 신규저널 1편)을 발표하였으며, 2편의 논문을 SCI급 저널에 제출하여 현재 심사를 받고 있고, 2편의 논문이 추가로 준비중이다. 본 연구를 통해 개발된 다중정량 동중체 표지 물질과 새로운 표지기술은 global market을 겨냥한 원천기술로 지적재산권 확보에도 힘을 기울여, 현재 국내 특허 1건이 등록되었고, 국내 특허 2건과 국제특허 1건이 출원되어 현재 심사를 받고 있다. 아울러 국내외 학술회의에 다수의 논문(국제 12편, 국내 7편)을 발표하였는데 그 중 1편은 우수논문상을 수상하였다.
구체적인 연구 결과는 다음과 같다. 첫째, 기존의 동중체 표지들과는 다른 화학구조를 가지면서 H/D-동위원소만을 이용한 multiplex mass-balanced H/D-isotope tags (mMBIT)을 개발하여 성능을 검증하였다. 유기합성팀 (KAIST, 이희윤)은 N-acyl-N'-alkyl glycine 구조를 기반으로 다양한 물성을 가진 유도체를 합성하고, 질량분석팀 (POSTECH, 신승구)은 표지된 모델 펩티드의 탄뎀질량 분석을 통해 정량신호이온을 검출하고 유도체 치환기에 따른 정량신호이온들의 세기 변화를 관찰하여 표지화합물의 구조를 최적화하였다. 유기합성팀과 연계하여 여러 가지 후보물질 중 가장 강한 정량신호이온을 주는 화합물을 H/D-동위원소로 암호화하여 4-plex 동중체 표지를 개발하였다. 생화학팀 (POSTECH, 윤혜주)은 mMBIT을 효모 단백질의 정량분석에 활용하여 다중 동중체 정량표지의 실용성과 효율을 검증하고 개선방안을 수립하였다. 둘째, 2-plex MBIT의 개념을 확장하여 새로운 다중정량분석법을 개발하였다. 2-plex 정량신호이온의 질량값을 다변화시킨 가변질량 2-plex MBIT을 개발하고, N 쌍의 2-plex MBIT을 조합하여 (N + 1)개의 시료를 동시에 다중 분석하는 multi-2-plex 정량분석법을 검증하였다. 이를 이용하여 생화학팀에서 준비한 효모의 열감응 단백질의 발현정도를 성공적으로 정량분석할 수 있었다. 또한 CH3/CD3로 암호화된 2-plex MBIT의 high-mass 정량신호이온이 3 Da 간격으로 나타나는 것을 개선하여 C2H5/C2D5로 암호화된 2-plex ethyl MBIT (eMBIT)을 합성하고 이온트랩 질량분석기를 이용한 탄댐질량분석으로 high-mass 정량신호이온이 5 Da 간격으로 나타나는 것을 확인하여 eMBIT의 성능을 검증였다. 셋째, 동중체 표지와 affinity 표지를 순차적으로 도입하여 단백체의 정량분석을 효과적으로 수행할 수 있는 새로운 표지전략을 수립하여 검증하였다. 리신의 측쇄에만 동중체 표지물질이 결합한 펩티드만을 선택적으로 avidin-biotin affinity chromatography로 분리하여 전체 트립틱 펩티드 중 약 20%만을 정량분석에 활용할 수 있도록 효소분해 전략을 수립하였다. 이를 위하여 산 조건하에서 biotin을 쉽게 분리시킬 수 있는 cleavable biotin affinity tag (CBAT)을 개발, 합성하였다. 유비큐틴 단백질에 새로운 표지전략을 적용해 본 결과, 동중체 표지가 리신에만 결합한 펩티드만을 선택적으로 분리할 수 있었다.
연구결과의 활용계획
지금까지 따로따로 개발한 동중체 표지물질 (mMBIT, eMBIT)과 affinity 표지 (CBAT)를 하나로 묶어 다기능성 표지로 만들고, 이를 단백체의 효율적인 분리와 다중 정량분석에 활용할 계획이다. 추가연구를 통하여 이온트랩질량분석기를 포함한 모든 종류의 질량분석기를 사용하여 단백질 정량분석을 고효율, 고정확도로 수행할 수 있는 원천기술을 확보하고자 한다. 본 연구팀의 학제 간 협동연구를 통하여 새로운 다기능 MBIT을 개발하고, 활용범위를 넓히며, 단백체 정량분석의 효율을 향상시키게 되면 궁극적으로는 기술이전 등을 통하여 동중체 표지시약을 Global Market에 출시할 수 있도록 노력할 계획이다.

Abstract ▼

Purpose& contents
The primary goal of this project was the development of chemical methods for multiplexed quantification and identification of proteins by using mass spectrometry. We developed the synthetic methods for deuterium isotope-coded isobaric tags.
Result
Through collaborations of

Purpose& contents
The primary goal of this project was the development of chemical methods for multiplexed quantification and identification of proteins by using mass spectrometry. We developed the synthetic methods for deuterium isotope-coded isobaric tags.
Result
Through collaborations of organic synthsis, mass spectrometry, and chemical biology groups, novel isobaric tags that enable multiplexed protein quantification using tandem mass spectrometry have successfully developed. In addition, we developed a high-throughput strategy of using isobaric tags for accurate and sensitive proteome identification and quantification.
The multiplexed mass-balanced H/D-isotope tags (mMBIT) and analytical methods using thereof were developed. The mMBIT has the structure of N-acyl-N'-alkyl glycine. Both acyl and alkyl substitutents can be varied with various chemical groups. In this research, eight different mMBIT chemicals were tested by experiment and theory to optimize the structures of acyl and alkyl substituents which provides the strong and consisitent quantitation signals upon tandem mass spectrometric analysis. The relative amounts of model proteins prepared by chemical biology group were accurately quantified with 4-plex version of mMBIT.
The new multiplexed quantification methods using 2-plex isobaric tags were also developed. With various 2-plex MBITs, (N+1)-plex quantifications of yeast proteins were successully performed by combinating N pairs of these 2-plex MBITs. This strategy was named as a multi-2-plex quantification method. We also developed and examined the ethyl MBIT (eMBIT) that yields strong high-mass quantitation signals with 5-Da mass spacing.
A highly-efficient strategy for proteome identification and quantification that consists of enzymatic digestion, isobaric tagging and avidin-biotin affinity separation were also established. For this strategy, novel cleavable biotin affinity tag (CBAT) was synthesized. With this strategy using MBITs and CBAT, 20% of total peptides digested from the protein mixture can be selectively isolated for mass spectrometric analysis.
We have published four research papers, two more manuscripts have been submitted in SCI journals, and two were in preparations. Four patents (3 domestic and 1 international) were applied. Of them, one (domestic) was granted.
Expected Contribution
Both mMBIT and eMBIT can expand the field of quantitative proteomics using mass spectrometry. This isobaric tags and analytical methods will enhance the accuracy and throughput of protein identification and quantification and increase the success rate of finding disease biomarker in clinical proteomics.

목차 Contents

• 중견연구자지원사업(핵심연구) 최종보고서 ... 1
• 목 차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 7
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 10
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 28
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 29
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 30
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 (신승구) ... 31
• 8. 공동연구책임자 대표적 연구실적 ... 31
• 9. 참고문헌 ... 32
• 10. 연구성과 ... 33
• 11. 기타사항 ... 38