초록 ▼

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
1. Bacillus 속이 만드는 기능성 물질 생산 관련 유전체 연구
● 혈전용해효소, polyglutamate (PGA) 생산 관련 주요 유전자들 클로닝 및 이들의 발현 조절 기작 연구
● 클로닝한 유전자들의 도입에 의한 해당 성분들의 생산량 변화 측정
● 재조합 균주들의 개발과 이들을 이용한 발효식품 제조 및 발효식품 품질 평가
2. 전통식품유래 미생물의 isoflavonoid 대사 관련 유전체 연구
● 전통장류에서 분리·동정된 우수 균주(Aspergillus, Ba

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
1. Bacillus 속이 만드는 기능성 물질 생산 관련 유전체 연구
● 혈전용해효소, polyglutamate (PGA) 생산 관련 주요 유전자들 클로닝 및 이들의 발현 조절 기작 연구
● 클로닝한 유전자들의 도입에 의한 해당 성분들의 생산량 변화 측정
● 재조합 균주들의 개발과 이들을 이용한 발효식품 제조 및 발효식품 품질 평가
2. 전통식품유래 미생물의 isoflavonoid 대사 관련 유전체 연구
● 전통장류에서 분리·동정된 우수 균주(Aspergillus, Bacillus 속)의 isoflavones 대사 관련 유전자의 발현 특성 규명
3. 전통장류에 존재하는 유용 미생물의 단백질체 연구
● 전통장류에서 분리·동정된 우수 균주(Aspergillus, Bacillus 속)의 단백질 발현 특성을 규명하고, 각 제품의 건강기능성과의 상관성을 규명함
● 전통장류 원료 콩 단백질의 선발균주에 의한 발효과정 중 단백질 패턴변화를 분석하고, 이를 바탕으로 제품의 품질 및 기능성 예측 모델 개발
4. 전통장류 섭취에 따른 생체내 단백질 발현패턴 및 isoflavones 대사체 분석
● 전통장류의 기능성과 관련된 분자수준에서의 작용기전을 규명하기 위한 방안의 하나로 전통장류 (예, 청국장 등)를 마우스에게 섭취시킨 후, 신체 부위별 단백질 발현패턴변화 분석
● 전통장류를 섭취시킨 마우스에서 isoflavones 대사체 분석 및 건강기능성 (예, 항산화 활성)과의 상관성 분석

Abstract ▼

This study was conducted to screen the high quality microorganisms suitable for manufacturing traditional fermented soy foods such as cheonggukjang, soy sauce, and soy paste (doenjang). The genomic and proteomic technologies were utilized for reliable identification of the microorganism. Various str

This study was conducted to screen the high quality microorganisms suitable for manufacturing traditional fermented soy foods such as cheonggukjang, soy sauce, and soy paste (doenjang). The genomic and proteomic technologies were utilized for reliable identification of the microorganism. Various strains in Bacillus and Aspergillus family which were isolated from traditional cheonggukjang and meju, respectively, were tested for their capability to produce soy products with health benefits including antioxidant activity.
Bacilli, major microorganisms found in traditional cheonggukjang, confer important health-related benefits to fermented soybeans. The production of γ-PGA is one example and fibrinolysisis is another. Genes responsible for the γ-PGA production were cloned from B. amyloliquefaciens CH86-1, a strain isolated from traditional cheonggukjang through this study, and the genetic organization was elucidated. A 4.5 kb fragment encompassing pgsBCA was introduced into B. subtilis and E. coli. Production of protein(s) was observed by SDS-PAGE and the presence of transcript was confirmed by slot blot analysis. More detailed studies are required for transforming a PGA-nonproducer into an efficient producer. Fibrinolytic enzymes were studied more in detail and bpr86-1 gene encoding bacillopeptidase F was cloned from B. amyloiliquefaciens CH86-1. These genes will be useful for the construction of strains for fermented soy products with enhanced health benefits.
A rapid and reliable RAPD-PCR method were also developed for the detection of Bacillus cereus, a common contaminant, from fermented soyfoods. All B. cereus strains produced 0.91 kb and 0.5 kb when S-30 was used as a single primer. A RAPD-PCR protocol was also developed to distinguish B. subtilis strains from closely related B. amyloliquefaciens and B. licheniformis strains. Accurate identification of a Bacillus species is helpful for the quality control of fermented foods.
Meanwhile, five Aspergillus oryzae strains were selected from Korean traditional meju manufactured in Sunchang Yeastopia by ITS-RFLP method. The absence of aflatoxin biosynthesis by five selected Aspergillus oryzae strains was confirmed by using RT-PCR. In addition, 8 β-glucosidase genes (ABG 1, 7, 9, 13, 21, 22, 30, and 31) from one of selected Asp oryzae strain were cloned and expressed in Saccharomyces cerevisiae. The β-glucosidase expressed on the yeast could hydrolyze various isoflavones in soybean. Although five strains of Aspergillus oryzae expressed different levels of the enzymes, they did not have significant effect on the profile of isoflavone derivatives during soybean fermentation. However, isoflavone profile of soybean was greatly altered depending upon soybean variety and fermentation period, with the highest concentration of free isoflavones at 4-5th day after fermentation in high isoflavone variety (Aga 3). The antioxidant activity of fermented soy was proportional to the free isoflavone content.
Two biotechnologically important enzymes, arabinofuranosidase and feruloyl esterase, were cloned and expressed in Pichia pastoris and their properties were characterized.
This research also undertook the proteome analysis of Bacillus and Aspergillus strains isolated from the traditionally prepared cheonggukjang and meju, proteome analysis of the intestinal mucosa from the rats fed with cheonggukjang, and observed the interaction of the pepsin-resistant soy proteins with the intestinal mucosa membrane proteins as well. Proteomes of Bacillus subtilis and B. amyloliquefaciens were separated on 2-D gels and identified by peptide mass fingerprinting. Due to the variations in genomic sequences, the identified proteins were overlapped less than 10%. The phenomenon is also true between same species. The proteome profiles obtained from the bacillus strains could be used to classify the microorganisms isolated throughout this project. In case of Aspergillus, 2-D proteome profiles agree each other very well within the same species (over 90%), such as between Aspergillus oryzae strains. However, proteome profiles between A. oryzae matched only by 50% and A. awamori only overlapped by less than 20%. This also suggests that the Aspergillus strains identified by genomic sequence data should be complemented by proteomic data for accurate identification and classification.
Proteomic analysis of the mucosa of the small intestine from the rats fed with cheonggukjang and soy showed differential expression of cytoskeletal proteins, particularly, tropomyosin, which cause the increase of the length of microvilli of the small intestine. This phenomenon could be caused by the interaction of the pepsin-resistant soy proteins with intestinal surface. The pepsin-resistant soy proteins were found to interact with a 32 kDa protein on the mucosa membrane. The interaction of soy proteins with small intestinal mucosa need to be further investigated.
In conclusion, we made major breakthrough in understanding microorganisms involved in manufacturing Korean traditional fermented soy foods. The information generated from this study should be exploited for improving manufacturing process of traditional fermented soy products.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 9
• CONTENTS ... 11
• 목 차 ... 12
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 14
• 1절 연구개발의 목적 ... 14
• 2절 연구개발의 필요성 ... 14
• 3절 연구개발의 범위 ... 17
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 19
• 1 절 국내외 연구현황 ... 19
• 1. Bacillus와 Aspergillus의 유전체 연구 ... 19
• 2. Bacillus와 Aspergillus의 단백질체 연구 ... 21
• 3. Bacillus와 Aspergillus에 의한 대사체 연구 ... 22
• 2절 본 연구팀의 연구결과가 국내외 기술개발현황에서 차지하는 위치 ... 22
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 23
• 1절 연구방법 ... 23
• 1. Bacillus amyloliquefaciens CH86-1에서 기능성 소재 생산관련 유전자 확보 ... 23
• 2. PGA 생성 유전자 클로닝 ... 24
• 3. 혈전용해효소 bpr86-1 클로닝 및 발현 ... 27
• 4. B. subtilis 그룹 균들간 구별을 위한 RAPD-PCR 방법 개발 ... 29
• 5. B. cereus 균주 신속한 검출을 위한 RAPD-PCR 방법 개발 ... 30
• 6. Bacillus 균주별 청국장 제조과정중 isoflavones profile 분석 및 항산화활성 평가 ... 31
• 7. 전통식품유래 곰팡이 이차대사산물 관련 유전체 연구 ... 33
• 8. 전통식품 유래 곰팡이의 isoflavonoid 대사 관련 유전체 연구 ... 34
• 9. 전통식품유래 곰팡이의 기능성 식품소재 생산관련 유전체 연구 ... 36
• 10. 전통 청국장에서 분리한 Bacillus 균주의 Proteome 분석 ... 40
• 11. 청국장 급여 쥐의 장점막 단백질체 변화 ... 40
• 12. 청국장 급여 쥐의 장점막의 구조 변화 분석 ... 40
• 13. 장점막 단백질과 콩단백질과의 상호 작용 ... 41
• 2절 연구결과 ... 43
• 1. PGA 생성 유전자 클로닝 및 발현 ... 43
• 2. 혈전용해효소 bpr86-1 클로닝 및 발현 ... 52
• 3. 중요 Bacillus 신속 동정을 위한 RAPD-PCR 방법 개발 ... 57
• 4. B. cereus 균주 신속한 검출을 위한 RAPD-PCR 방법 개발 ... 61
• 5. 표준 청국장 제조과정중 isoflavones 대사체 및 항산화 활성의 변화 ... 64
• 6. 전통식품유래 곰팡이 이차대사산물 관련 유전체 연구 ... 74
• 7. 전통식품 유래 곰팡이의 isoflavonoid 대사 관련 유전체 연구 ... 84
• 8. 전통식품유래 곰팡이의 기능성 식품소재 생산관련 유전체 연구 ... 109
• 9. 전통 청국장에서 분리한 Bacillus 균주의 Proteome 분석 ... 117
• 10. 청국장 급여 쥐의 장점막 단백질체 변화 ... 125
• 11. 청국장 급여 쥐의 장점막의 구조 변화 분석 ... 133
• 12. 장점막 단백질과 콩단백질과의 상호 작용 ... 135
• 13. Aspergillus 균주의 proteome 분석 및 정확한 동정과 관리를 위한 분석결과의 활용 ... 142
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 151
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 153
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 154
• 제 7 장 참고문헌 ... 155