초록 ▼

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
○ 제 1세부연구과제
- 미니돼지의 췌장과 간에서 PEPCK와 ICER Iγ 유전자를 동정하고 분석한 후 PEPCK와 ICER Iγ 유전자 과발현 운반 벡터를 제작하기 위해 미니돼지의 PEPCK 프로모터 부위와 인간의 인슐린 프로모터 부위를 세분화 하여 프로모터 활성도를 평가한다. 활성도 평가를 통해 활성도가 가장 높은 프로모터 부위에 동정된 PEPCK 와 ICER Iγ 유전자를 삽입하고 형질이 전환된 미니돼지 체세포를 선별 가능하게 Enhanced Green Fluorescent Prote

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
○ 제 1세부연구과제
- 미니돼지의 췌장과 간에서 PEPCK와 ICER Iγ 유전자를 동정하고 분석한 후 PEPCK와 ICER Iγ 유전자 과발현 운반 벡터를 제작하기 위해 미니돼지의 PEPCK 프로모터 부위와 인간의 인슐린 프로모터 부위를 세분화 하여 프로모터 활성도를 평가한다. 활성도 평가를 통해 활성도가 가장 높은 프로모터 부위에 동정된 PEPCK 와 ICER Iγ 유전자를 삽입하고 형질이 전환된 미니돼지 체세포를 선별 가능하게 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)와 neomucin resistent 유전자가 포함 된 selection cassette 부위를 삽입하여 PEPCK와 ICER Iγ 유전자 과발현 벡터를 제작한다. 공여핵원세포인 체세포 제조를 위해 돼지의 귀에서 체세포를 분리하고 트랜스펙션 기술을 통해 PEPCK와 ICER Iγ 유전자 과발현 벡터를 체세포에 삽입한다. 삽입 후, 체세포 배양액에 G-418을 첨가하여 4주 동안 배양하여 neomycin 내성과 EGFP 발현 여부로 세포를 선별한다. 선별된 체세포는 지노믹 유전자를 분리하여 특정 프라이머를 이용한 PCR을 통해 최종적으로 PEPCK와 ICER Iγ 유전자 형질전환 세포주를 확립한다.
○ 제 2세부연구과제
- 돼지 미성숙란의 최적의 체외성숙 시스템을 확립하기 위하여 돼지 미성숙 난자의 호르몬의 첨가시기 및 호르몬-free에 통하여 최적의 체외성숙 시스템을 확립하고, 형질전환 복제배아의 최적의 체외배양 시스템 확립하기 위하여 돼지 배아의 배양액에 아세칠화 억제제인 TSA 첨가시 돼지 핵이식 배아의 발달율, 배반포의 총세포수, 아세칠화와 메칠화, 세포사멸 및 세포사멸에 관련된 유전자의 비교 조사한다. 체세포에 의한 형질전환 복제배아의 도입유전자 검증 및 형질전환 배아의 대리모에 이식 시스템을 확립하기 위하여 RT-PCR 등 분자생물학기법과 형광현미경에의한 방법을 이용하여 형질전환 돼지 배반포에서 도입 유전자 발현을 확인하며 최상의 형질전환 돼지배아 이식용 대리모군으로 구축한다.
○ 제 1협동연구과제
- 도축장에서 채취된 난소로부터 미성숙난자를 선발, 체외 배양하여 성숙을 유도한 후 체세포 핵이식을 위한 수핵난자로 사용한다. 체세포핵이식에 공여핵원으로 트랜스펙션 기술을 통해 제작된 PEPCK와 ICER Iγ 유전자를 과발현하는 미니돼지 체세포 주에서 EGFP가 발현하는 세포만을 UV transilluminator를 통해 선별하여 이용한다. 체세포 핵이식 과정을 통해 제작된 핵이식란은 체외배양을 통해 배반포기 단계까지 발달 시켜 초기 배아 발달율 및 삽입 유전자의 발현 정도를 Realtime-PCR을 통해 평가한다. 평가를 통해 발달율 및 유전자 발현율이 가장 높은 형질전환 세포주를 선별하여 준비된 대리모에 외과적 수술을 통해 이식한다. 이식된 날을 기준으로 약 30일 후 초음파 진단을 통해 임신여부를 판단하고 약 113일에서 118일의 임신기간을 거쳐 복제미니돼지를 생산한다. 생산된 복제돼지는 UV transilluminator를 이용해 GFP발현 유무를 확인하고, 귀 및 꼬리 조직을 채취하여 특정 프라이머를 이용한 PCR 및 RT-PCR을 통해 최종적으로 PEPCK와 ICER Iγ 유전자를 과발현하는 형질전환 복제 미니돼지임을 확인한다.

Abstract ▼

Specification No.1
Diabetes mellitus is a metabolic disease caused by impaired insulin secretion from the pancreatic β cells and increased insulin resistance in peripheral tissues. Type 1 diabetes mellitus (also referred to as insulindependent diabetes mellitus or T1DM) is characterized by the fa

Specification No.1
Diabetes mellitus is a metabolic disease caused by impaired insulin secretion from the pancreatic β cells and increased insulin resistance in peripheral tissues. Type 1 diabetes mellitus (also referred to as insulindependent diabetes mellitus or T1DM) is characterized by the failure to produce sufficient quantities of insulin. Individuals with this form of the disease require exogenous insulin for survival. Type 2 diabetes mellitus (also referred to as non-insulin-dependent diabetes mellitus or T2DM) is caused by defects in insulin secretion along with insulin resistance. In T2DM, fasting hyperglycemia is attributed to excessive hepatic glucose production, and increased gluconeogenesis has been ascribed to increased transcriptional expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK). Recently, the overexpression of inducible cyclic AMP (cAMP) early repressor (ICER) Iγ in rodent pancreatic β cells was found to induce insulin deficiency and glucagon overproduction similar to that found in human diabetes mel itus. ICER Iγ with only a DNA binding domain interrupts the transcriptional regulation of the cAMP responsive element-binding protein (CREB) target genes. Based on this information, we generated miniature pig fibroblasts overexpressing PEPCK via transgenes to provide an animal model of human T2DM. Also, we hypothesized that the overexpression of ICER Iγ the most powerful competitor to CREB, could be useful for generating a pig model of diabetes.
First, various regions of the promoter showed high levels of activity in the presence of glucocorticoids, a PEPCK gene inducer, in liver cells compared to a positive control promoter. The selected promoter region for a liver-specific expression system was adopted based on the current targeting vector containing two selection markers, green fluorescence protein and a neomycin-resistance gene. The linearized vector was introduced into pig fibroblasts which facilitated liver-specific PEPCK overexpression and screening according to the two selection markers. In the present study, we used a liposome-mediated transfection protocol rather than a virus-mediated gene delivery system, since the virus may cause side effects. Following transfection, 46 colonies out of 33 transfection trials had positively integrated the overexpression vector, indicating that a relatively high transfection efficiency rate was obtained by the liposomal-mediated system. Thus, we recommend the optimal liver-specific expression system for safand effective transfection of pig cells.
Second, we evaluated the promoter activities of the human insulin gene for the βcell-specific overexpression of ICER Iγ in the pig pancreas. The maximum promoter activity region [-1,431 nucleotides (nt) to +1 nt, +1 = the transcriptional start site] of the insulin gene presented an activity level 3-fold higher than a promoterless construct. Second, ICER Iγ overexpression controlled by this promoter region significantly blocked the glucose-mediated insulin transcription, such as that regulated by the viral promoter in the pancreatic β cell line, MIN6. This suggests that the human insulin promoter may facilitate the overexpression of ICER Iγ in porcine pancreatic β cells. In addition, the overexpression of ICER Iγ in porcine β cells may induce human-like type 1 diabetes mellitus in pigs. In the present study, we generated transgenic fibroblasts containing ICER Iγ cDNA controlled by the human insulin promoter, as well as two screening markers, the green fluorescence protein and the neomycin resistance gene. In conclusion, these fibroblasts may provide a source for somatic cell nuclear transfer to generate a pig model that mimics human diabetes mellitus.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 9
• 목 차 ... 13
• 제1장 서 론 ... 14
• 제1절 현대인 대사증후군의 심각성 및 제2형 당뇨병 연구의 필요성 ... 14
• 제2절 외래유전자가 도입된 형질전환 돼지배아의 생산과 이식을 위한 연구의 필요성 ... 15
• 제3절 대사증후군 관련 제2형 당뇨병 질환 돼지 모델 생산의 필요성 ... 16
• 제4절 대사증후군 관련 제2형 당뇨병 모델동물 선정 ... 17
• 제5절 대사질환 중 당뇨병 산업동향 및 당뇨병 돼지 질환 모델 활용 관련시장 ... 17
• 제6절 대사증후군 관련 당뇨 돼지 모델 ... 18
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 20
• 제1절 국내 연구 현황 ... 20
• 제2절 국외 연구 현황 ... 20
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 21
• 제1절 미니돼지 PEPCK와 ICER Iγ 유전자 삽입체 개발 및 형질전환 세포주 확립 ... 21
• 제2절 대사질환 다중 유전자 도입 형질전환 돼지배아 생산기법 개선 ... 25
• 제3절 체세포핵이식기법을 이용한 대사질환 PEPCK 유전자가 도입된 미니복제돼지 개발 ... 50
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 64
• 제1절 목표대비 달성도 ... 64
• 제2절 정량적 성과 ... 65
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 69
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 70
• 제7장 기타 중요 변동사항 ... 71
• 제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 72
• 제9장 참고문헌 ... 73