[보고서]유용균주의 대사핵심 유전자를 활용한 인삼 사포닌 전환 기술 개발 및 이용

유용균주의 대사핵심 유전자를 활용한 인삼 사포닌 전환 기술 개발 및 이용
Development and application of ginsenoside conversion using microbial metabolic core genes 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	경희대학교 Kyung Hee University
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2013-02
과제시작연도	2012
주관부처	농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA)
등록번호	TRKO201300014283
과제고유번호	1395028530
사업명	차세대바이오그린21
DB 구축일자	2013-08-26
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201300014283

초록 ▼

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
가. 연차별 연구수행 내용 · 범위 및 방법
1세부(경희대 김연주) 대사경로 핵심유전자 확보 및 대사공학을 활용한 신규 유용물질 생산
○ 인삼 사포닌 분해 유용 미생물 탐색
- 보유 유용균주를 활용한 사포닌 전환 활성 검색
- Minor 사포닌 생성 유전자원의 확보
○ 미생물 대사공학에 이용 가능한 대사경로 핵심유전자확보
- 유용 균주를 이용한 fosmid library구축
- Fosmid library 중 유용유전자원 선발
○ 구축된 library 로부터 대사핵심 유전자 및 유용 유전자 탐색 시스템 구축 및 발굴
- Glucosidase, galactosidase 등 당 가수분해 유전자 확보.
- Glucosidase family구분에 따른 인삼 분해 유전자의 탐색.
- Ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1등의 major 사포닌을 활용한 minor ginsenoside 생산 확인.
○ 선발된 유용 유전자의 효모로의 형질 전환 (Vector construction)
2세부(경희대 이옥란) 유용유전자의 발현 최적화 연구
○ 당분해효소 (β-glucosidase)의 분리 및 정제 후 인삼 사포닌을 특이적으로 분해하는 활성 확인.
○ 사포닌 생합성 관련유전자 및 다양한 사포닌의 합성을 촉진하는 것으로 밝혀진 Cytochrome p450 및 Glycosyltransferase 유전자 확보 및 클로닝 (두 유전자군에 대한 고려인삼내 전체 EST 유전자를 확보, 인삼 사포닌의 다양화에 공헌할만한 유전자를 선발. 각 두 개의 유전자씩 전체 시퀀스를 확보하였으며 현재 형질전환체 유기, 그 기능 및 사포닌 함량변이 추이를 검증).
○ 사포닌 대사합성에 관련된 유전자는 식물의 방어기작에도 관련성이 높으며, 그중 인삼유래 PR10 유전자 및 Calmodulin 유전자의 발현 정도와 Potassium nitrate 처리에 의한 사포닌 생합성관련 유전자 및 항산화관련 유전자의 발현량 조사함 (3편의 SCI 논문 발표).
○ 인삼 사포닌의 생합성은 크게 MVA (세포질내) 및 MEP (엽록소내) 생합성과정을 통해 생성됨. 스테롤 및 트리터펜의 작용을 동시 조절할 수 있을 것으로 사료되는 첫 rate-limiting 단계는 효소인 HMG Co-A에 대한 유전, 생화학적, 및 분자생물학적 다양한 방법의 연구에 의해 이 유전자가 광과 밀접한 관련성을 가지며 결과적으로 사포닌의 생산량 조절에 관여함을 밝혀 그 결과에 대한 논문 제출 예정.

Abstract ▼

In this project, we collected lactic acid bacteria and construct the data base of their ginsenoside bioconversion pathways. From ginseng rhizophere, we isolated Microbacterium esteraromaticum GS514 converted ginsenoside Rb1 to Rg3. After fosmid library we checked 5 ORFs and cloned the bgp1, bgp2, bgp3, bgp4, bgp5 with different ginsenoside bioconversion pathways. Ginsenosides Re and Rg1 were transformed by recombinant β-glucosidase (Bgp1) then analyzed by HPLC and LC/MS. The bgp1 gene consisted of 2,496 bp encoding 831 amino acids. The enzyme catalyzed the hydrolysis of the glucose attached to the C-20 position of ginsenosides Re and Rg1 at 37°C and pH 7.0. The product of Bgp1 conversion of the ginsenoside Re was Rg2 and conversion of the ginsenoside Rg1 produced Rh1.The α-L-arabinopyranosidase gene (bgp2) consists of 2,430 bp encoding 809 amino acid with homology to the glycosyl hydrolase family 2 protein domain. Ginsenosides Rb2, compound O and F3 were transformed into ginsenosides Rd, F2 and F1 respectively. Bgp2 hydrolyzed only α-L-arabinopyranose moiety attached to the C-20 position of ginsenosides.
Major gnsenoside Rb2 was transformed by recombinant β-glycosidase (Bgp3) to the more pharmacologically active minor compuond Y and compound K. The bgp3 gene consists of 2,271 bp encoding 756 amino acids which have homology to the glycosyl hydrolase family 3 protein domain. The Bgp3 hydrolyzed the inner glucose moiety attached to the C-3 position of ginsenoside Rb2, followed by hydrolyzed the arabinopyranose moiety attached to the C-20 position. Bgp3 hydrolyzed the ginsenoside Rb2 along the following pathway: Rb2 → compound Y → compound K. We cloned these bgp1, 2, 3 in Yeast vector for soluble protein production. In Panax ginseng, we analyzed the sapone related core genes and elucidated their physiological and genetic characterization under biotic/abiotic stresses.

목차 Contents

표 지 ... 1
제 출 문 ... 2
요 약 문 ... 3
SUMMARY ... 8
목 차 ... 10
제1장 서 론 ... 11
제1절 연구 개발의 목적과 필요성 및 범위 ... 11
제2장 국내외 기술개발 현황 ... 14
제1절 연구개발대상 기술의 국내 • 외 현황 ... 14
제2절 연구개발 결과가 국·내외 기술개발현황에서의 위치 ... 17
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 20
제1절 1세부: 대사경로 핵심유전자 확보 및 대사공학을 활용한 신규 유용물질 생산 ... 20
제2절 2세부: 유용 유전자의 발현 최적화 연구 ... 50
제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 69
제1절 목표대비 달성도 ... 69
제2절 정량적 성과 ... 71
제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 75
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 76
제7장 기타 중요 변동사항 ... 76
제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비현황 ... 76
제9장 참고문헌 ... 76

표/그림 (39)

표 Fig. 1. 인삼의 사포닌 종류
표 그림 1. 인삼의 사포닌 종류
표 Fig. 2. Screening of the bacterial strains by Esculin assay
표 Fig. 3. Fosmid library screening for bioconversion from the major ginsenosides Rb1, using lactic acid bacteria.
표 Fig. 4. Fosmid library screening for bioconversion from the major ginsenosides Re to minor ginsenoside.
표 Fig. 5. Microbacterium esteraromaticum에 의한 Production of ginsenoside Rg3 by Microbacterium
표 Fig. 6. PPD type ginsenoside
표 Fig. 7. PPT type ginsenoside
표 Fig. 8. Fosmid vector library
표 Fig. 9. Fosmid library and ORF analysis
표 Fig. 10. Effect of pH (a) and temperature (b) on the activity and stability of bgp1
표 Fig.11. Mass spectra of ginsenoside Re after hydrolysis by bgp1. Mass spectrum of Rg2, m/z=809=[MW+Na+H], MW=785.
표 Fig.12. Mass spectra of ginsenoside Rg1 after hydrolysis by bgp1. Mass spectrum of Rh1, m/z=663=[MW+Na+H, MW=639.
표 Fig. 13. Mass spectra of ginsenoside R1after hydrolysis by bgp1
표 Fig.14. Effect of pH and temperature on the activity and stability of bgp2.
표 Fig.15. Mass spectra of ginsenoside compound O after reaction with bgp2
표 Fig.16. TLC analysis of the transformation of ginsenoside Rb1, Rd, and compound O by bgp2 at pH 6.0, 37°C. S; standard, reaction time; 3 h.
표 Fig.17. Effect of pH and temperature on the activity and stability of bgp3.
표 Fig.18. Mass Spectra of Ginsenoside compound O after the bgp3 reaction
표 Fig.20. Transformation of ginsenoside Rg3 into PPD by bgp3 from Microbacterium esteraromaticum GS514.
표 Fig.19. TLC analysis of the transformation of ginsenoside Rb1, Rd, and compound O by bgp3 at pH 6.0, 37°C. S; standard, reaction time; 3 h.
표 Fig.21. Bioconversion pathway of ginsenoside R1 by bgp3
표 Fig.22. Bioconversion pathway using the bgp1,2,3
표 Fig. 23. Domain analysis of the bgp1 -bgp4
표 Fig.24. Crystal structure of the bgp1,2,3,4
표 Fig.25. Production of the rare ginsenoside 20(S)-Rg3 from the major ginsenosides Rb1, Rb2 and Rd in Saccharomyces cerevisiae by co-expression of β-glucosidase (Bgp1) and α-L-arabinopyranosidase (Bgp2) from Microbacterium esteraromaticum
표 Fig.26. Production of the rare ginsenoside compound K from the ginseng root extract in Saccharomyces cerevisiae by co-expression of β-glucosidase (Bgp3) and α-L-arabinopyranosidase (Bgp2) from Microbacterium esteraromaticum
표 그림 26. 인삼에서의 식물스테롤 및 인삼 사포닌 생합성 경로.
표 Fig. 28. bgp1에 의한 bioconversion pathway
표 그림 29. bgp2에 의한 bioconversion pathway
표 Fig. 30. bgp3에 의한 bioconversion pathway
표 Fig. 31. Merge pattern analysis of PgHMGR-CFP and ER, Peroxisome maker.
표 Fig. 32. Expression analysis of HMGR in transgenic plants
표 Fig. 33. Comparison of ginsenoside contents after treatment of Inhibitor and precursor
표 Fig. 34. PgHMGRox이 보이는 pale-green, albino 표현형
표 Fig. 35. 사포닌 함량변화에 따른 식물발육상의 변화
표 Fig. 36. PgGT1 과 PgGT2 유전자 시퀀스 및 구조
표 Fig. 37. 인삼 Cyp P450 유전자
표 Fig. 38. Expression analysis of Pgγthionin in biotic and abiotic stress

과제명(ProjectTitle) :	-
연구책임자(Manager) :	-
과제기간(DetailSeriesProject) :	-
총연구비 (DetailSeriesProject) :	-
키워드(keyword) :	-
과제수행기간(LeadAgency) :	-
연구목표(Goal) :	-
연구내용(Abstract) :	-
기대효과(Effect) :	-

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 제목(한글), 저자명(한글), 발행일자, 전자원문, 초록(한글), 초록(영문) 관리번호, 제목(한글), 제목(영문), 저자명(한글), 저자명(영문), 주관연구기관(한글), 주관연구기관(영문), 발행일자, 총페이지수, 주관부처명, 과제시작일, 보고서번호, 과제종료일, 주제분류, 키워드(한글), 전자원문, 키워드(영문), 입수제어번호, 초록(한글), 초록(영문), 목차
저장형식	Text(ASCII format) Excel format
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증

유용균주의 대사핵심 유전자를 활용한 인삼 사포닌 전환 기술 개발 및 이용
Development and application of ginsenoside conversion using microbial metabolic core genes 원문보기