보고서 정보
주관연구기관 |
전남대학교 Chonnam National University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2013-02 |
과제시작연도 |
2012 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201300014307 |
과제고유번호 |
1395027747 |
사업명 |
차세대바이오그린21 |
DB 구축일자 |
2013-08-26
|
DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201300014307 |
초록
▼
Ⅲ. 연구개발의 내용
1. 형질전환 동물을 이용한 이종간 이식용 뼈의 생체적합성 시험
가. 형질전환 돼지 이식용 뼈 이식 시 발생하는 거부 반응 연구
(1) 사람 말초혈액단핵구 세포(PBMC) 분리
: 건강한 지원자로부터 제공받은 혈액에서 말초혈액단핵구 세포를 분리하여 실험에 사용함. 실온 상태의 혈액 3 ml를 동량의 Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, USA)가 들어 있는 15 ml tube에 일정한 속도로 천천히 분주한 다음 원심분리(400 xg, 30분)하고 상층액을 파스퇴르 파
Ⅲ. 연구개발의 내용
1. 형질전환 동물을 이용한 이종간 이식용 뼈의 생체적합성 시험
가. 형질전환 돼지 이식용 뼈 이식 시 발생하는 거부 반응 연구
(1) 사람 말초혈액단핵구 세포(PBMC) 분리
: 건강한 지원자로부터 제공받은 혈액에서 말초혈액단핵구 세포를 분리하여 실험에 사용함. 실온 상태의 혈액 3 ml를 동량의 Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, USA)가 들어 있는 15 ml tube에 일정한 속도로 천천히 분주한 다음 원심분리(400 xg, 30분)하고 상층액을 파스퇴르 파이펫으로 제거하였음. 단핵세포층을 새로운 conical tube에 옮기고 10 ml의 차가운 식염수를 넣고 섞은 뒤 250 xg에서 10분간 원심분리한 후 상층액은 제거하고 세포펠렛은 5 ml의 식염수에 현탁하여 다시 250 xg로 원심분리하는 단계를 반복하였음. 마지막에 세포펠렛을 RPMI 배지(10% 혈액공여자 혈장, penicillin/streptomycin)에 현탁한 후 세포수를 측정하고 5 x 106/ml 농도로 실험에 사용함.
(2) 돼지 생 뼈에 의한 사람 면역세포의 활성화 측정
: 분쇄된 돼지 생 뼈는 RPMI에 현탁한 후 40 um pore size의 cell strainer를 통과시켜 pore size보다 큰 뼈입자들을 제거함. 단백질 농도는 bradford assay로 측정하였으며 사람 말초혈액단핵구 세포가 들어 있는 round bottom 96 well plate 또는 24 well plate에 단백질 농도 기준으로 100 ug/ml 씩 첨부함. 세포는 5% CO2 gas 조건의 37℃ 인큐베이터에서 RNA용은 24시간, ELISA용은 48시간 배양하여 활성화시킴.
(3) RNA 추출
: 세포를 수집하여 원심분리한 후 상층액을 제거하고 세포 펠렛에 1 ml의 RNAiso (Takara, Japan)을 넣고 세포 펠렛을 앆전히 풀어준 뒤 실온에서 5분간 방치 후 chloroform 200 μL을 첨가하여 튜브 뚜껑을 닫은 후 용액에 우윳빛이 돌 때까지 섞었음. 실온에서 5분간 방치한 후 12,000 xg로 4℃에서 5분간 원심분리하여 얻은 투명한 상층액을 500 μL 덜어내어 새로운 tube에 옮김. 그 후 isopropanol 250 μL를 첨가한 후 실온에서 10분간 방치한 뒤 다시 12,000 xg에서 10분간 원심분리하여 RNA를 침전시킴. 상층액을 조심해서 버리고 75% ethanol을 1 ml 첨가한 후 잘 섞은 뒤 750 xg로 4℃에서 5분간 원심분리하고 상층액을 조심해서 버린 후 RNA 펠렛을 건조시킨 후 RNase free water로 녹임.
(4) cDNA 합성
: 추출한 RNA는 농도를 측정한 후 Primescript 1st strand cDNA synthesis kit를 이용하여 cDNA를 합성함.
(5) Real time PCR
: 합성된 cDNA를 1:5로 희석하여 PCR을 수행함. 그리고 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 항존유전자(house keeping gene)로 사용하여 결과를 정규화하고 delta CT로 계산하였음.
(6) ELISA
: 사이토카인 농도 측정은 Ebioscience사의 sandwich ELISA kit를 사용하였음.
ELISA용 96 well plate에 측정하고자 하는 사이토카인의 primary 항체를 제조사의 술식에 따라 코팅하였음(4℃, overnight). ELISA washing buffer (0.25% tween 20 in PBS)로 5회 세척한 후 1x assay diluent를 200 ㎕씩 각 well에 넣고 실온에서 한 시간 방치하였음. 그 후 washing buffer 5회 세척한 후 1x assay diluent로 희석한 사이토카인 스탠다드와 희석된 샘플을 100 ㎕씩 넣고 실온에서 2시간 인큐베이션하였음. 이어서 washing buffer로 5회 세척하고 1x avidin-HRP conjugate를 100 ㎕ 첨가한 후 실온에서 30분간 방치하였음. 다시 washing buffer로 5회 세척하고 TMB 용액을 첨가하였음. 5 - 15분간 효소반응이 일어나면 stop solution 넣어 효소 활성을 중단시키고 450 nm에서 OD 값을 측정하여 사이토카인 농도를 계산하였음.
나. 형질전환 돼지의 골격별 골조성비 및 구조적 특성 분석
(1) 미니돼지와 형질전환 돼지에서의 구조적 특성 분석
: 형질전환 돼지 뼈와의 비교를 위해 미니돼지와 형질전환 돼지 희생 후 앞다리 및 뒷다리, 골반부위를 채취하여 부위별로 방사선촬영을 실시하였음다. 형질전환 돼지 뼈의 생체 안전성 및 유효성 평가
(1) 유기물 함유 돼지 해면질골 이식재 제작
: 일반돼지와 형질전환 돼지(알파갈 넉아웃)의 사지골격을 수술적으로 채취한 후 표면 연부조직을 물리적으로 제거하고 70% 에탄올과 생리식염수로 소독과정을 거친 뒤 해면질골을 분리함. 분리한 해면질골은 분쇄 후 -70℃에 보관함. 형질전환돼지의 사지골격 중 일부는 10% 과산화수소에 3시간 동안 침지하여 뼈 표면에 존재할 수 있는 각종 이물질을 제거하였음. 이어서 인산앆충액(PBS)에 넣은 다음 톱을 이용하여 취급하기 용이한 크기로(2×2 cm) 각각 절단하고 절단된 뼈를 PBS로 여러 번 세척하여 골수부위를 제거하였음. 절단된 뼈를 액체질소에 1시간 동안 침지하여 앆전히 동결시킨 다음 분쇄기(Retsch, MM400, 독일)에 넣어서 입자로 제조하였고 제조된 입자를 회수한 다음 에탄올을 이용하여 분쇄과정에서 생성된 기름을 제거하였음.
그리고 -80℃의 냉동고에 넣어서 앆전히 동결시킨 후 동결건조기를 이용하여 건조시켰고, 제조된 뼈 입자는 -70℃에서 보관하였음.
(2) 랫드의 두개골 결손부 형성 후 골이식 및 평가
: 체중 250-280 g의 건강한 7주령 수컷 Sprague-Dawley 랫드(Samtaco, Osan, Korea) 36마리를 온도 23±2℃, 상대습도 60±10%로 유지하고 12시간의 명암주기가 유지되는 실내에서 사료와 식수를 자유로이 공급하며 사육함. 실험에 사용하기 전 랫드를 10마리씩 대조군(Critical defect, CD), 일반돼지 해면질 생 뼈 이식군(Live bone General, Live G), 형질전환 돼지 해면질 생 뼈 이식군(Live bone transgenic, Live T) 및 형질전환 돼지 화학처리 해면질골 이식군(Chemical treated transgenic, Treated T)으로 나누어 랫드의 두개부에 8 mm trephine bur를 이용하여 원형 결손부를 형성한 후 일반돼지와 형질전환 돼지의 해면질 생 뼈와 탈지 및 탈단백과정을 거친 형질전환 돼지 해면질골을 이식함. 1주 및 4주째에 랫드를 마취 하에서 채혈한 뒤 혈액검사를 실시하였고, 방혈 치사하여 이식부위와 면역관련 주요 장기(비장, 흉선, 익하림프절)를 부검하였음. 면역관련 주요장기는 적출하여 장기 무게를 측정하였고, diamond disc로 골결손부위를 포함하여 골조직을 채취한 뒤 Micro CT (Skyscan, Aartselaar, Belgium)를 촬영하여 골부피(Bone Volume, BV) 및 골밀도(Bone moneral density, BMD)를 분석함. 이후 골조직은 10% 중성 포르말린에 고정시킨 후 Calci-ClearTM Rapid (National diagnostics, Atlanta, USA)로 탈회 후 포매하여 microtome (Reichet-Jung 820)으로 5 ㎛ 두께의 절편을 제작한 다음 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 실시하여 골결손부위의 염증발현 여부 및 신생골 형성을 관찰함.
라. 형질전환 돼지 뼈의 생체적합성 검토
(1) 유기물 미함유(열처리) 돼지 해면질골 이식재 제작
: 일반돼지의 사지골격을 수술적으로 채취한 후 표면 연부조직을 물리적으로 제거하고 해면질골을 분리하여 증류수 안에 넣어 취급하기 용이한 크기로(2×2 cm) 톱을 사용하여 각각 절단하였음. 그 후 절단된 뼈에서 골수 및 이물질을 증류수로 제거하고 동결건조하였음. 동결건조된 각 부위별 뼈를 고온열처리기(Muffle Furnace, MF-21G, JeioTech, 한국)에 넣은 다음 400℃와 1200℃에서 각각 3시간 동안 열처리하였음. 열처리된 뼈는 분쇄기(Retsch, MM400, 독일)를 이용하여 입자크기를 1 mm 이하로 제조하였으며 입자에 함유되어 있을 수 있는 유기물 재를 제거하기 위해 제조된 뼈입자를 아세톤에 침지하여 초음파 세척기에서 30분 동안 처리하였음.
그리고 세척된 뼈 입자는 동결건조과정을 거쳐 수분을 앆전히 제거한 뒤 -70℃에서 보관하였음.
(2) 랫드의 두개골 결손부 형성 후 골이식 및 평가
: 체중 250-280 g의 건강한 7주령 수컷 Sprague-Dawley 랫드(Samtaco, Osan, Korea) 36마리를 온도 23±2℃, 상대습도 60±10%와 12시간의 명암주기가 유지되는 실내에서 사료와 식수를 자유로이 공급하며 사육함. 실험에 사용하기 전 랫드를 10마리씩 대조군(Critical defect, CD), 400℃ 열처리 돼지 해면질골 이식군(400℃) 및 1200℃
열처리 돼지 해면질골 이식군(1200℃)으로 나누고 8 mm trephine bur를 이용하여 랫드의 두개부에 원형 결손부를 형성한 후 열처리한 형질전환돼지 해면질골을 이식함.
4주 및 8주째에 랫드를 희생하여 이식부위 조직을 채취하고 Micro CT (Skyscan, Aartselaar, Belgium)를 촬영하여 골부피(Bone Volume, BV) 및 골밀도(Bone moneral density, BMD)를 분석함. 이후 골조직은 10% 중성 포르말린에 고정시킨 후 Calci-ClearTM Rapid (National diagnostics, Atlanta, USA)로 탈회 후 포매하여 microtome (Reichet-Jung 820)으로 5 ㎛ 두께의 절편을 제작한 다음 hematoxylin and eosin (H&E) 염색하여 골결손부에서의 신생골 형성을 관찰함.
2. 형질전환 돼지 뼈의 물리·화학적 특성 평가 및 이식용 뼈 개발
가. 미니돼지 뼈의 골격별 입자 제조
: 미니돼지의 골격별 뼈를 공급받아 입자로 제조하고 이의 물리화학적 특성을 평가하였음. 또한 기존 D사에서 판매중인 돼지 뼈로 제조되어 시판되고 있는 골이식재와도 물리화학적 특성을 비교 평가하였음. 미니돼지의 골격별 뼈는 대퇴골(S1), 골반(S2), 경골 및 잔골(S3), 요골 및 척골(S4), 상앆골(S5)로 분류하여 유기물 미함유 뼈 입자와 유기물 함유 뼈 입자로 각각 제조하였음.
(1) 유기물 미함유 뼈 입자 제조
: 유기물 미함유 돼지 뼈 입자는 먼저 골격별 5가지의 뼈를 증류수 안에 넣어서 톱을 이용하여 취급하기 용이한 크기로(2×2 cm) 각각 절단하고, 골수 및 이물질을 증류수로 제거한 다음 동결건조하였음. 동결건조된 각 부위별 뼈는 고온열처리기(Muffle Furnace, MF-21G, JeioTech, 한국)에 넣은 다음 1,200℃에서 3시간 동안 열처리하여 뼈에 들어있는 유기물을 제거하고 분쇄기(Retsch, MM400, 독일)를 이용하여 입자크기를 1 mm 이하로 제조하고 입자에 함유되어 있을 수 있는 유기물 재를 제거하기 위하여 아세톤에 제조된 뼈 입자를 침지하여 초음파 세척기에서 30분 동안 처리하였음. 세척된 뼈 입자는 동결건조과정을 거쳐 수분을 앆전히 제거한 뒤 -20℃에서 보관함.
(2) 유기물 함유 뼈 입자 제조
: 회수된 각 부위별 뼈를 10% 과산화수소에 3시간 동안 침지하여 뼈 표면에 존재할 수 있는 각종 이물질을 제거한 뒤 인산앆충액(PBS)에 넣은 다음 톱을 이용하여 취급하기 용이한 크기로(2×2 cm) 각각 절단하였고, 절단된 뼈를 PBS로 여러 번 세척하여 골수부위를 제거함. 절단된 뼈는 액체질소에 1시간 동안 침지하여 앆전히 동결시킨 다음 상기의 분쇄기(Retsch, MM400, 독일) 넣어서 입자로 제조함. 제조된 입자를 회수한 다음 메탄올을 이용하여 분쇄과정에서 생성된 기름을 최대한 제거하고 -80℃의 냉동고에 넣어서 앆전히 동결시킨 후 동결건조기를 이용하여 건조한 뒤 -20℃에서 냉동 보관하였음.
나. 유기물 함유 또는 미함유 형질전환 돼지 뼈 입자 제조
: 본 연구에서는 형질전환 돼지 뼈의 성능을 평가하기 위해 일반돼지 뼈 입자를 대조군으로 사용함. 또한 천연 뼈의 구조는 골조직이 치밀한 해면질골(concellous bone)과 피질골(cortical bone)로 구성되어 있는 것을 감안하여 상기 두 종류 돼지 뼈를 해면질골과 피질골로 분리하여 연구를 수행하였으며 상기의 각 골격별 미니돼지 뼈 입자 제조공정을 통하여 좀 더 세분화되고 최적화된 공정을 개발하여 두 종류의 돼지 뼈 입자를 제조함.
(1) 유기물 함유 일반 미니돼지 및 형질전환 돼지 뼈 입자 제조
: 형질전환 돼지 뼈는 농촌진흥청에서 제공 받아 대퇴골을 분리하여 사용하였고, 일반 미니돼지 뼈는 전남대학교 수의과학대학에서 제공 받아 사용함. 두 가지 돼지 뼈는 절단 전 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 다음 2 cm로 절단하고 다시 PBS에 24시간 동안 침지하여 뼈 속에 함유되어 있는 피를 제거하였고, 이때 2시간 단위로 PBS를 교환함. 그 후 뼈 조각의 분쇄를 위해 액체질소에 30분 동안 침지하고 동결된 뼈 조각들을 분쇄기에 넣고 분쇄하여 입자크기를 1 mm 이하로 제조함. 입자에 함유되어 있는 지방은 메탄올로 여러 번 세척하여 최대한 제거하였고, -80℃의 냉동고에서 앆전히 동결시킨 다음 -20℃에서 48시간 동안 동결건조 하였음.
이렇게 제조된 유기물 함유 형질전환 및 일반돼지 뼈 입자들은 -20℃에 보관함
(2) 유기물 미함유 형질전환 및 일반돼지 뼈 입자
: 절단 후 PBS로 세척과정을 거친 뼈 조각을 10% 과산화수에 12시간 동안 침지하여 뼈 입자에 함유되어 있는 이물질 및 색소를 제거하였음. 이어서 70℃이상 증류수에 12시간 동안 침지하여 1차적으로 지방 및 연조직을 제거하고 뼈 속에 함유된 지방성분을 앆전히 제거하기 위하여 클로로포름/메탄올 (1:1 v/v) 용액에 130 rpm의 동적상태에서 48시간 침지한 다음 증류수로 24시간동안 세척하여 동결건조하였고, 이때 2시간 단위로 새로운 증류수를 교체면서 세척함. 탈지가 앆료된 돼지 뼈 입자는 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 4% 수용액에 130 rpm의 동적상태에서 48시간 침지하여 뼈 입자속에 존재하는 단백질류를 제거하고 2시간 단위로 새로운 증류수를 교체하면서 24시간동안 세척 후 동결건조하였음. 탈지 및 탈단백이 앆료된 돼지 뼈 입자는 400℃에서 5시간 또는 1,200℃에서 3시간 동한 열처리하여 최종 유기물이 모두 제거된 형질전환 및 일반돼지 뼈 입자를 제조함
다. 제조된 돼지 뼈 입자의 물리 •화학적 특성 분석
(1) 돼지 뼈 입자의 형태학적 특성 분석
: 제조된 미니돼지의 각 골격별 뼈 입자의 형태학적 특성, 형질전환 및 일반돼지 뼈 입자의 열처리 온도에 따른 형태학적 특성은 SEM (Hitachi, S-4300, 일본)을 이용하여 측정하였음. 이때 모든 시료는 앆전 건조상태에서 금박 코팅하여 5 kV로 측정하였음.
또한 제조된 입자의 칼슘/인의 비율은 EDS (energy dispersive spectrometer)로 분석하였음.
(2) 돼지 뼈 입자의 결정특성 분석
: XRD (x-ray diffractometer, Rigaku, Max-2500, 일본)을 사용하여 분석하였음. 이때 측정조건은 40 kV, 200 mA에서 2◦/mim으로 하여 2θ 5도에서 60도 범위를 측정하였음. 그리고 열처리 온도에 따른 돼지 뼈 입자의 결정크기는 하기의 Scherrer 방정식을 이용하여 분석하였음.
$D=\frac{0.94\lambda}{\beta_{1/1}cos\theta}$
여기서 D는 결정의 크기(domain size)이고, λ는 입사 x-ray 파장, β1/2 는 특정 회절 피크(211)의 반가폭, θ는 최대 피크에서의 회절각임.
(3) 돼지 뼈 입자의 표면 화학적 작용기 분석
: attenuated total reflectance fourier transform infrared (ATR FTIR) spectroscopy (IRPrestige-21, Shimadzu, 일본)로 분석하였음. 이때 조건은 분해능을 4.0 cm-1로 하고 scan수를 30으로 하여 측정하였음. 각 돼지 뼈 입자들은 막자사발을 이용하여 최대한 분쇄하여 스펙트럼을 얻었음.
(4) 돼지 뼈 입자의 표면 원소 분석
: x-ray photoelectron spectroscopy (XPS, Quantera SXM, ULVAC-PHI, 일본)을 이용하여 측정하였음. 이때 조건은 Al Kα (hv = 1486.6 eV, 25 W)선을 이용하여 pass energy 13.00 eV, beam size 100 ㎛으로 측정하였고, photoelectrons의 emission angle은 45°로 유지하여 시료의 데이터를 얻었음.
(5) 돼지 뼈 입자의 칼슘 및 인 용출특성 분석
: inductively coupled plasma mass (ICP) spectrometer (Optima 7300DV, PerkinElmer, 미국)을 이용하여 측정하였음. 먼저 각 돼지 뼈 입자 0.2 mg을 10 mL의 증류수에 침지한 다음 37℃의 항온조에서 정적인 상태로 방치하였음. 이어서 각 주어진 시간에 시료를 꺼내어 1,000 rmp에서 3분 동안 원심분리하여 돼지 뼈 입자들을 침전시키고 추출용액 10 mL을 회수하였음. 이어서 다시 새로운 증류수 10 mL를 추가하고 vortex를 이용하여 침전된 돼지 뼈 입자들을 증류수에 충분히 분산시킨 다음 항온조에 다시 투입하였음. 회수된 추출용액은 0.42 ㎛의 기공크기를 갖는 필터로 필터링하여 4℃에서 보관하였음. ICP 측정에서 인은 파장 213.617 nm에서 칼슘은 317.927 nm에서 측정하였음.
Abstract
▼
There are many bone loss cases owing to traumatic injury and disease, these lead to bone defects and ultimately result in defects within the skeletal structure. In many of these cases, a substitutionary material must be used to fill the bone defect, and the clinical and economic impacts of treatment
There are many bone loss cases owing to traumatic injury and disease, these lead to bone defects and ultimately result in defects within the skeletal structure. In many of these cases, a substitutionary material must be used to fill the bone defect, and the clinical and economic impacts of treatments of bone defects are increasing. Xenografts are one of the most common alternatives to the autografts. Bone xenografts, such as bovine or porcine bone, which may be freeze-dried, demineralized freeze-dried, pressure and heat sterilization or irradiated process, are used to substitute other bone grafting materials. However, bovine-derived bone grafting materials bone is not free of zoonosis, such as bovine spongiform encephalopathy (BSE) [13]. In this aspect, porcine-derived xenografts, with crystalline and morphological structures resembling human cancellous bone, seem to be the most appropriate grafting material for bone grafting procedures and has a relatively low risk of zoonosis. However, there are many problems resolved such as immune response or poor biocompatibility.
The main problem with such xenografts is immune rejection mediated by natural antibodies in human to donor pig. The alpha 1,3 galactosyl transferase (α-gal) knockout pigs are available for xenotransplantation. Since bone tissues are less immunogenic than soft tissues, bone tissues from α-gal knockout pigs should be better candidate compared to soft tissue for xenotransplantation to humans. However, the possibility of pig bone xenotransplantation is not well studied. In this study we investigated whether lack of Gal expression in bone tissue is associated with reduced inflammatory cytokine production by human PBMC after stimulation with pig bone tissues.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요 약 문 ... 3
- SUMMARY ... 13
- 목 차 ... 20
- 제1장 서 론 ... 21
- 제1절 연구개발의 필요성 ... 21
- 제2절 경제적·산업적 중요성 및 필요성 ... 22
- 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 25
- 제1절 국내 기술개발 현황 ... 25
- 제2절 국외 기술개발 현황 ... 26
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 29
- 제1절 연구개발수행 내용 ... 29
- 제2절 연구개발수행 결과 ... 36
- 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 72
- 제1절 목표대비 달성도 ... 72
- 제2절 정량적 성과 ... 72
- 제3절 관련분야 기술발전 기여도 ... 74
- 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 75
- 제1절 추가연구의 필요성 ... 75
- 제2절 타 연구에의 응용 ... 76
- 제3절 현재 추진 중인 추가적인 업적 ... 76
- 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 77
- 제1절 국내 연구 현황 ... 77
- 제2절 국외 연구 현황 ... 79
- 제3절 국내외 특허 및 기술 동향 분석 ... 80
- 제7장 기타 중요 변동사항 ... 86
- 제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 87
- 제9장 참고문헌 ... 88
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.