초록 ▼

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
○ 코리네박테리움의 세포기능 재설계 기술을 이용한 L-threonine 대량생산 기술 개발
- 유전체 재조합 기술을 이용한 L-threonine 생합성 대사과정의 재구성 (피드백 억제 조절작용의 해제, 새로운 분지점 차단 기술 개발 , 작용제한점의 발현 증대)
- Glucose Dehydrogenase Pathway (GDP)의 활성 변화를 통한 PPP 대사흐름의 증대
- GDP 관련 신규 (novel) 유전자의 동정 및 발현 변화를 통한 NADPH 생합성 증대가 L-threoni

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
○ 코리네박테리움의 세포기능 재설계 기술을 이용한 L-threonine 대량생산 기술 개발
- 유전체 재조합 기술을 이용한 L-threonine 생합성 대사과정의 재구성 (피드백 억제 조절작용의 해제, 새로운 분지점 차단 기술 개발 , 작용제한점의 발현 증대)
- Glucose Dehydrogenase Pathway (GDP)의 활성 변화를 통한 PPP 대사흐름의 증대
- GDP 관련 신규 (novel) 유전자의 동정 및 발현 변화를 통한 NADPH 생합성 증대가 L-threonine 생합성에 미치는 효과 검증
○ 코리네박테리움의 대사적 표현형 분석을 통한 탄소 대사과정의 유기적 관계규명
- Phenotypic Microarray 표현형 분석을 통한 L-threonine 생합성 증대를 위한 작용 제한점 분석
- 코리네박테리움 L-threonine 생합성 대사과정의 thrC 조절기작 탐색
- 코리네박테리움 L-threonine 생합성 대사과정 thrB의 피드백조절 실험에 필요한 효소의 순수 분리 완료
○ 코리네박테리움의 비교유전체 및 오믹스 기반 대사정보구축
- L-Lysine 생산 균주의 유전체 resequencing을 통한 SNP/InDel정보 확보 및 SNP/InDel에 의한 다양한 탄소중심 대사관련 유전자들의 차등 발현여부 RT-PCR 분석
- 코리네박테리움 L-lysine 생산균주의 발현 단백질 2D 분석 수행
- SNP/InDel에 의한 다양한 유용 유전자들의 차등 발현여부를 전사체 분석을 통하여 확인하기 위하여 transcriptome 분석 수행

Abstract ▼

L-Threonine is an essential amino acid which is widely used for feed and pharmaceutical application. With the purpose of generating a microbial strain for L-threonine production in Corynebacterium glutamicum, genes involved in the central carbon metabolism were inactivated so as to modulate the intr

L-Threonine is an essential amino acid which is widely used for feed and pharmaceutical application. With the purpose of generating a microbial strain for L-threonine production in Corynebacterium glutamicum, genes involved in the central carbon metabolism were inactivated so as to modulate the intracellular level of NADPH, and to evaluate their effects on L-threonine production in C. glutamicum. Upon inactivation of the gluconate kinase gene (gntK) led to a 75% increase in intracellular NADPH concentration, which resulted in a 9-fold increase in L-threonine production. In addition, upon inactivation of the newly identified glucose dehydrogenase genes (gdh) led to a 60% increase in intracellular NADPH concentration, which resulted in a 34.3% increase in L-threonine production. These results indicate that excess NADPH may not be necessarily rate-limiting, but is required for increased L-threonine production in C. glutamicum. We also tried to block the branched-pathway of L-threonine biosynthesis to increase more carbon flux towards L-threonine biosynthesis. Upon expressing the UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase gene (murE) from Streptococcus pyogenes, the dihydrodipicolinate synthase gene (dapA) responsible for the branched-point of L-threonine biosynthesis towards L-lysine biosynthesis became available to be knocked-out in C. glutamicum, which resulted in a 9-fold increase in L-threonine biosynthesis. Taken together, the newly constructed strain of C. glutamicum ATCC13032 was able to accumulate a 3.27 g of L-threonine per liter medium in flask fermentation.
In order to produce higher amount of L-threonine from C. glutamicum, we analyzed wild-type and lysin-producing strains of C. glutamicum with the Phenotypic MicroArray method. We found that those gene involved in ribose metabolism may affect the cellular NADPH biosynthesis and thus the level of threonine. A key enzyme in the pathway for L-threonine production in C. glutamicum is homoserine kinase (thrB). Homoserine kinase is competitively inhibited at the active site by threonine, which makes it difficult to relieve feedback inhibition through mutation. We found that at the entry of the active site of homoserine kinase there is a conserved alanine residue and thus we hypothesized that mutation of this residue could relieve feedback inhibition. We have successfully constructed several mutant forms of this alanine residue and some of them still retained the enzymatic activity. We will test whether they have lost or diminished the feedback inhibition by threonine by determining Km and Vmax in the presence of L-threonine in the reactions. The significance of this research is that it provides a novel approach for relief of feedback inhibition, since we attempted to genetically separate the catalytic activity and feedback inhibition in the active site of homoserine kinase. This approach may be applied later to other amino acid production in C. glutamicum and other amino acid over-producing organisms.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• S U M M A R Y ... 6
• 목 차 ... 8
• 제1장 서 론 ... 9
• 제1절 연구개발의 필요성 ... 9
• 제2절 연구개발의 범위 및 목적 ... 10
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 12
• 제1절 국내 기술개발 현황 ... 12
• 제2절 국외 기술개발 현황 ... 12
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 14
• 제1절 연구방법 ... 14
• 제2절 연구내용 및 결과 ... 15
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 59
• 제1절 목표대비 달성도 ... 59
• 제2절 정량적 성과 ... 62
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 64
• 제1절 추가연구의 필요성 ... 64
• 제2절 기업화 추진방안 ... 65
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 67
• 제7장 기타 중요 변동사항 ... 68
• 제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 69
• 제9장 참고문헌 ... 70